中草药具有天然、低毒、低残留及无耐药性等优势，富含维生素、矿物质、苷类、生物碱及多糖等多种营养成分和活性物质，可以调节动物肠道菌群结构，改善肠道健康，从而促进动物的生长发育[1]。近年来，天然中草药添加剂作为抗生素的替代品，已经在畜禽养殖业中广泛应用[2-3]。据统计，在肉鸡养殖过程中，中草药制剂的使用率较高，占比44.83%，其中黄羽肉鸡养殖中中草药制剂的使用率达到61.36%[4]。牛、鹿、羊等反刍动物肠道包括细菌、真菌、古菌及原生动物等微生物，是影响动物生产与健康的重要因素之一。肠道微生物参与动物机体的物质吸收、物质代谢、消化吸收、维持肠道菌群稳态及机体健康等生理活动，也可能通过多种代谢产物（通常以挥发性脂肪酸为主）参与甘油三酯（TG）的合成以及调控脂肪细胞、肌细胞内的信号通路，进而影响肉品质[5-7]。本试验研究中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清免疫指标、细胞因子、抗氧化指标及肠道菌群的影响，为深入探究中草药添加剂调控西门塔尔肉牛肠道菌群的具体机制提供参考。1材料与方法1.1试验材料中草药购自安徽亳州中药材市场，由党参、黄芪、山楂、茯苓、白芍、连翘、鸡血藤、女贞子、补骨脂、白扁豆及泽泻组成，按3∶3∶2∶2∶2∶2∶2∶1∶1∶1∶1比例混匀，粉碎过200目筛，分装于小袋，密封保存。1.2试验设计与饲养管理采用单因素随机区组试验设计，将20头体重为（268.80±4.95）kg的12月龄健康西门塔尔肉牛分为2组，组间初始体重差异不显著，每组10个重复，每个重复1头肉牛。西门塔尔肉牛选自吉林市西门塔尔肉牛养殖场。对照组（CG组）饲喂基础饲粮，试验组（AG组）在基础饲粮中额外添加100 g/(头·d)中草药添加剂。预试期5 d，正式试验期60 d。试验期间定期消毒，驱虫，疾病检测，自由采食、饮水。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00青贮玉米秸秆39.67干物质/%94.19干秸秆30.33有机物/%88.31玉米19.20粗蛋白/%7.73豆粕1.50粗脂肪/%1.93棉粕1.50粗灰分/%5.88胚芽粕2.25钙/%0.73膨化大豆1.50磷/%0.55丰圆肽0.02中性洗涤纤维/%63.79尿素0.30酸性洗涤纤维/%32.54酒糟蛋白1.50粗纤维/%28.37小苏打0.44总能/(MJ/kg)17.20食盐0.29预混料1.50注：1.每千克预混料为饲粮提供：VA 144 000 IU、VD3 36 000 IU、VE 800 mg、生物素20 mg、铜360 mg、钙80 g、铁5 980 mg、锰1 310 mg、锌2 780 mg、碘41 mg、钴15 mg、硒35 g、叶酸1.512 5 mg、泛酸1.265 mg、烟酸400 mg。2.营养水平均为实测值。1.3样品采集1.3.1血样采集正式试验第60 d，对西门塔尔肉牛空腹进行颈静脉采血，将注射器的血样注入促凝管中静置至血清析出，3 500 r/min离心10 min，血清分装入微量离心管中，-80 ℃保存。1.3.2直肠粪样采集正式试验第60 d，使用无菌棉签刮取西门塔尔肉牛直肠末端粪便样本约10 g，放入无菌冻存管，立即投入液氮中，带回实验室，-80 ℃保存。1.4测定指标及方法1.4.1血清免疫、细胞因子和抗氧化指标使用上海酶联免疫试剂盒测定血清免疫指标和细胞因子指标，包括免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）及肿瘤坏死因子-γ（TNF-γ）。使用南京建成生物工程研究所试剂盒测定血清抗氧化指标，包括总抗氧化能力（T-AOC）、过氧化氢酶（CAT）、丙二醛（MDA）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）。1.4.2直肠粪样菌群多样性将直肠粪便样本送至上海生工生物工程股份有限公司进行微生物16S rDNA高通量测序。引物序列为：515F：5'-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'；806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'。二代测序得到的PE reads，依据overlap关系进行拼接、区分、质量质控、过滤，采用Usearch软件进行OTU聚类（ASV去噪）分析，利用Mothur软件计算α多样性指数。文库大小及质量通过2%琼脂糖凝胶电泳、Qubit® 4.0荧光计等评估，在250 bp/300 bp时，采用Illumina MiseqTM/HisegTM软件对数据序列双端读长。1.5数据统计与分析采用Excel 2010软件对试验数据进行归纳整合，SPSS 27.0软件进行独立样本t检验。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清免疫球蛋白含量的影响（见表2）由表2可知，与CG组相比，AG组西门塔尔肉牛血清IgA含量提高了12.70%（P0.05），血清IgM含量提高1.32%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T002表2中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清免疫球蛋白含量的影响项目IgA/(mg/L)IgM/(mg/L)IgG/(g/L)P值0.0020.5240.364CG组517.56±14.02372.08±7.101.30±0.03AG组583.27±10.90377.00±2.391.25±0.052.2中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清免疫细胞因子含量的影响（见表3）由表3可知，与CG组相比，AG组西门塔尔肉牛血清IL-6含量提高了7.58%（P0.05），TNF-α含量降低了2.21%（P0.05）。两组西门塔尔肉牛血清IL-2和TNF-γ含量差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T003表3中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清免疫细胞因子含量的影响项目IL-2IL-6TNF-αTNF-γP值0.9700.0220.4410.741CG组200.53±7.8231.55±0.3431.63±0.73145.48±3.27AG组200.13±6.8933.94±0.7730.93±0.49143.27±5.73ng/L2.3中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与CG组相比，AG组西门塔尔肉牛血清T-SOD活性提高了3.13%（P0.05），MDA含量降低了28.87%（P0.05），T-AOC提高了1.39%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T004表4中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清抗氧化指标的影响项目T-AOC/(U/mL)CAT/(U/mL)MDA/(μmol/L)T-SOD/(U/mL)GSH-Px/(U/mL)P值0.7620.4870.0010.0040.962CG组3.59±0.153.27±0.413.81±0.2094.00±0.79118.17±6.09AG组3.64±0.112.89±0.342.71±0.1996.94±0.58117.80±4.692.4中草药添加剂对西门塔尔肉牛直肠菌群的影响2.4.1测序数据质控分析为判断本研究测序数据量是否足够，样本中随机抽取一定数量的序列，以抽取的数据量为横轴，以观测到的OTU数量为纵轴，绘制牛肠道微生物的稀释曲线，见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.F001图1西门塔尔肉牛肠道微生物的稀释曲线注：1-1、1-2、1-3、1-4、1-5、1-6为CG组的6个重复，2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6分别为AG组的6个重复；下图同。由图1可知，当测序量到达50 000时，各组的稀释曲线趋于平稳，表明此次测序数据量符合要求；当测序量到达75 000时，表明此样本测序的深度已足够，测序结果涉及了牛肠道中绝大多数的微生物，可以进行微生物多样性分析。本试验共收集到12个直肠粪便样本，进行测序生成1 237 539个有效序列，序列平均长度为249.87 bp。为进行OTU聚类，非重复序列（不含单序列）按照97%相似性，总计得到了24 231 OTU，AG组和CG组唯一的OTU数分别为61个和39个（见图2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.F002图2OTU韦恩图2.4.2中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群α-多样性的影响（见表5）由表5可知，AG组西门塔尔肉牛肠道菌群Shannon、Chao1和Ace指数比CG组提高了0.17%、1.51%和0.96%（P0.05），表明饲粮添加中草药可能会提高西门塔尔肉牛肠道菌群群落多样性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T005表5中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群α-多样性的影响项目Shannon指数Chao1指数Ace指数Simpson指数P值0.7500.4220.6220.097CG组5.76±0.022 293.34±18.402 278.76±20.050.011 9±0.000 4AG组5.77±0.032 328.10±37.242 300.75±38.300.010 9±0.000 32.4.3中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群组成的影响（1）中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群门水平组成的影响（见表6）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T006表6中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群门水平组成的影响项目厚壁菌门拟杆菌门疣微杆菌门未分类的菌门其他P值0.0030.0200.9340.3750.416CG组49.53±0.5141.51±0.570.68±0.166.80±0.081.48±0.08AG组46.59±0.5844.21±0.790.70±0.147.12±0.331.39±0.08由表6可知，CG组和AG组西门塔尔肉牛肠道菌群在门水平上主要归类为厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），约占总数的90%以上。AG组西门塔尔肉牛肠道中拟杆菌门的相对丰度比CG组提高了6.50%（P0.05），疣微杆菌门的相对丰度比CG组提高了2.94%（P0.05），厚壁菌门的相对丰度比CG组降低了5.94%（P0.05）。研究表明，饲粮添加中草药添加剂增加了西门塔尔肉牛肠道拟杆菌门和疣微杆菌门相对丰度，降低了厚壁菌门的相对丰度。（2）中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群属水平组成的影响（见表7）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.001.T007表7中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群属水平组成的影响项目CG组AG组P值居海事城球杆菌属5.16±0.165.59±0.240.162另枝菌属4.62±0.255.38±0.400.137地中海单胞菌属3.23±0.072.96±0.220.274阿克曼氏菌属0.55±0.140.53±0.120.947未分类瘤胃菌属25.32±0.2123.11±0.210.001未分类拟杆菌属18.49±0.3119.30±0.810.374未分类梭菌目菌属9.68±0.309.13±0.200.163未分类拟杆菌目属6.71±0.577.72±0.230.134未分类细菌属6.80±0.087.12±0.330.375未分类厚壁菌属4.20±0.253.83±0.150.225未分类毛螺菌科3.97±0.204.06±0.170.731未分类拟杆菌科1.41±0.071.24±0.040.069未分类的氨基酸球菌科1.21±0.051.19±0.050.762由表7可知，在属水平上，CG组和AG组西门塔尔肉牛肠道菌群相对丰度较高的菌群主要为居海事城球杆菌属（Phocaeicola）、另枝菌属（Alistipes）、地中海单胞菌属（Mediterranea）、未分类瘤胃菌属（unclassified_Ruminococcaceae）、未分类拟杆菌属（unclassified_Bacteroidetes）、未分类梭菌目菌属（unclassified_Clostridiales）、未分类拟杆菌目属（unclassified_Bacteroidales）和未分类细菌属（unclassified_Bacteria），约占总数的80%以上。AG组西门塔尔肉牛肠道中未分类瘤胃菌属的相对丰度显著低于CG组（P0.05），居海事城球杆菌属和另枝菌属的相对丰度比CG组提高了8.33%和16.45%（P0.05）。3讨论3.1中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清免疫球蛋白的影响IgA、IgM和IgG约占总免疫球蛋白的99%，在调节免疫应答中发挥主要作用，可衡量血清中免疫球蛋白的整体水平[8-9]。补中益气的中药党参中含有的免疫活性物质多糖可以提高动物血清中IgG、IgM和IgA的含量[10]。活性物质黄芪多糖也具有免疫调节作用。桂文龙等[11]研究发现，饲喂黄芪多糖可以显著提高湖羊血清中免疫球蛋白A含量。张腾龙等[12]试验表明，饲粮中添加连翘等中草药可显著提高奶牛血清IgA和IgM含量，表明中草药添加剂能够提高奶牛的免疫功能。樊堃等[13]采用由女贞子、白芍及黄芪等组成的中草药超微粉饲喂断奶仔猪，发现断奶仔猪血清IgG、IgM和IgA含量显著提高。本研究中，饲喂中草药添加剂的西门塔尔肉牛血清IgA含量有所提高，与上述研究结果相似。3.2中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清细胞因子的影响细胞因子IL-6可促进T淋巴细胞活化和增生，对B淋巴细胞也具有促进作用[14]。本试验中，西门塔尔肉牛血清IL-6含量提高了7.58%，TNF-α含量有降低的趋势，这与骆雪等[15]的试验结果相似，表明添加适量中草药添加剂能够降低促炎症因子的释放，防止炎症的发生，提高牛的免疫功能。黄芪多糖对三硝基苯磺酸（TNBS）诱导的大鼠溃疡性结肠炎具有治疗作用，其机制与减少结肠组织炎症因子释放、改善肠道黏膜屏障功能有关[16]。饲喂黄芪多糖可使小鼠拟杆菌门相对丰度增加，厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门与厚壁菌门的比值升高，说明黄芪多糖能够调节肠道菌群结构，增加有益菌数量，提高机体免疫力，减少炎症因子的释放，促进抗炎因子的产生[17]。白芍的主要有效成分是白芍总苷，白芍总苷可通过调节自身免疫性甲状腺炎（AIT）大鼠肠道菌群（厚壁菌门相对丰度降低，拟杆菌门相对丰度升高）来调控炎性因子的水平[18]。茯苓多糖可能对JAK2/STAT3通路具有抑制作用，可以减轻急性胰腺炎（AP）大鼠肠道屏障功能损伤和炎性反应[19]。温肾助阳的补骨脂能够提高机体的抗氧化能力，促进肠黏膜修复，改善肠道健康[20]。3.3中草药添加剂对西门塔尔肉牛血清抗氧化功能的影响机体抗氧化的机制为提高机体内抗氧化酶活性和抑制多不饱和脂肪酸的氧化[21]。本试验中，与CG组相比，饲喂中草药添加剂的肉牛血清T-SOD活性提高了3.13%，MDA含量降低了40.59%。柳胜贤等[22]在山羊饲粮中添加黄芪等中草药，结果表明，黄芪添加组山羊血清T-SOD活性显著提高，血清MDA含量显著降低。王冉[23]在牛饲粮中添加黄芪、党参及山楂等复方中药后，牛血清T-AOC极显著提高，T-SOD活性显著提高；在牛饲粮中添加党参、山楂、茯苓及白芍等复方中药后，牛血清中T-AOC显著提高，T-SOD活性显著提高，MDA含量显著降低。山楂黄酮能够抑制脂质过氧化，从而降低血清MDA含量[24-25]。鸡血藤含有黄酮和酚酸，可以清除DPPH自由基，从而提高抗氧化能力[26-27]。此外，也有研究发现，补骨脂含有的双补骨脂酚A、B具有抗氧化活性，可能与存在的多个酚羟基有关，酚羟基可直接清除DPPH自由基[28]。3.4中草药添加剂对西门塔尔肉牛肠道菌群的影响反刍动物胃肠道内的有益菌可以起到生物屏障作用，能够促进机体代谢、消化和吸收，还可以维持微生态环境的稳定和菌群平衡[29]。肠道微生物可将消化的饲粮转化为可代谢的营养物质，以提高反刍动物对饲料的利用率。本研究结果表明，西门塔尔肉牛饲粮中添加100 g/(头·d)中草药添加剂有提高西门塔尔肉牛肠道微生物Shannon、Chao1和Ace指数的趋势，说明饲粮中添加中草药添加剂可能会增加牛肠道微生物中存在的物种数。饲料利用率的提高与拟杆菌门和疣微菌门的丰度呈正相关。DENOU等[30]研究发现，饲喂山楂粉的小鼠肠道中拟杆菌门、变形菌门和疣微菌门丰度显著提高。刘成武等[31]给犬饲喂中草药添加剂（黄芪、山楂等）35 d，发现中草药添加剂组犬肠道中厚壁菌门的相对丰度显著减少。本研究结果显示，在门水平上，西门塔尔肉牛肠道微生物中厚壁菌门和拟杆菌门较丰富，与吕尚揆等[32]、魏倩倩等[33]的研究结果一致。在门水平上，拟杆菌门的相对丰度显著提高，与高文婧等[34]的研究结果一致。拟杆菌门主要降解非纤维碳水化合物，厚壁菌门主要降解纤维素和蛋白质[35]。肠道菌群在多糖的吸收过程中发挥重要作用，多糖可能通过调节肠道菌群的比例增加有益菌的相对丰度，降低有害菌的相对丰度[36]。本试验中，中草药添加剂（黄芪、党参、白芍和山楂等）中的多糖降低了西门塔尔肉牛肠道厚壁菌门相对丰度，提高了拟杆菌门相对丰度，同时增加了拟杆菌门/厚壁菌门比值，促进了饲粮的消化与吸收。肠道菌群中厚壁菌门与拟杆菌门的比值与脂肪沉积有关[37]。植物多糖可作为肠道菌群重要能量来源之一，对多糖进行降解，生成一些单糖以及一些具有生物活性的代谢产物，如短链脂肪酸，从而促进机体对其吸收和利用，促进肠道健康[38]。居海事城球杆菌属（Phocaeicola）是人与动物肠道中的一类共生菌，具有维持动物机体健康的作用[39]。此外，中草药添加剂中的黄酮类和类激素还能够通过促进免疫器官的发育及免疫细胞应答来增强动物机体的免疫力，具有调节新陈代谢和内分泌的功能。因此，调节肠道菌群对增强机体抵抗力、促进动物生长具有积极作用。4结论本研究结果表明，饲粮中添加100 g/(头·d)中草药添加剂可以提高西门塔尔肉牛免疫力、抗氧化性能，改善肠道健康。