肝脏是鱼体内最大的消化腺，在鱼类营养、代谢和免疫方面起到重要作用，具有消化和解毒等生理功能[1-2]。肝脏功能受损会诱使机体出现其他疾病，使肝脏产生空泡变性、炎性细胞浸润、功能异常和代谢紊乱等一系列问题[3-4]。近年来，为降低饲料成本，红鱼粉在鳗鲡饲料中的使用比例逐渐升高。但红鱼粉中组胺含量高，可导致鳗鲡肝脏出现健康问题。组胺可导致鱼体产生氧化应激[5]。目前，为缓解鱼类养殖中不同胁迫因子导致的氧化应激，饲料中可添加能够在体内发挥抗氧化作用的添加剂[5-6]。饲料中添加300 mg/kg原花青素可有效缓解组胺导致的美洲鳗鲡幼鱼产生的氧化应激，从而改善肝脏健康[7]。目前自然界中虾青素的抗氧化能力较强，可提高脂多糖胁迫下乌鳢（Channa argus）[8]、高脂饲料胁迫下大口黑鲈（Micropterus salmoides）[9]、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）[10]等鱼类肝脏抗氧化能力，降低血清转氨酶活性，改善肝脏健康。但是，目前未见虾青素缓解饲料组胺胁迫的相关报道。因此，本试验在导致美洲鳗鲡幼鱼产生氧化应激的高组胺饲料中添加不同水平虾青素，通过血清转氨酶活性、肝脏抗氧化能力及肝脏组织形态等指标的变化，研究虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏健康的影响，为虾青素在鳗鲡饲料中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验设计美洲鳗鲡幼鱼购自福建省福清市渔溪鳗场。将暂养7周后的400尾初重为（25.01±0.17）g的美洲鳗鲡幼鱼随机分为4个处理组，即对照组（CK组）、H组、H+AST4组和H+AST8组，分别饲喂基础饲料、高组胺饲料及在高组胺饲料基础上添加4、8 mg/kg虾青素的饲料，每组4个重复，每个重复25尾鱼。H组饲料组胺水平设置参考以往研究中导致美洲鳗鲡幼鱼肝脏氧化损伤最严重的饲料组胺水平（650 mg/kg）[11]；基础饲料和高组胺饲料中的组胺水平为132、662 mg/kg（均为实测值）。虾青素添加水平主要参考大口黑鲈[9]、虹鳟[10]和卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）[12]在胁迫条件下添加2~10 mg/kg虾青素提高机体抗氧化能力的试验结果。试验期70 d。1.2试验饲料与饲养管理基础饲料为福清市海美生物科技有限公司生产的粉状黑仔鳗商业饲料，主要由白鱼粉、红鱼粉、预糊化淀粉、膨化大豆、维生素和矿物元素等组成。基础饲料营养水平见表1。在基础饲料中添加500 mg/kg组胺配制高组胺饲料，将组胺与基础饲料采用逐级扩大法混匀，再放入搅拌机中均匀搅拌20 min。组胺由上海源叶生物科技有限公司提供，有效含量98%。在高组胺饲料中分别添加4、8 mg/kg虾青素配制H+AST4组和H+AST8组饲料，将虾青素按剂量与高组胺饲料采用逐级扩大法混匀，再放入搅拌机中均匀搅拌20 min。虾青素由厦门昶科生物科技有限公司提供，有效含量0.3%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.009.T001表1基础饲料营养水平项目粗蛋白粗脂肪灰分水分含量46.145.1714.995.44%养殖试验在集美大学水产试验场进行，试验开始前将1 000尾试验鱼暂养在两个PVC养殖缸（直径1.1 m，高0.8 m）中，暂养期间每天早晚（6：00和18：00）将基础饲料与水按1∶1.1混合并揉成团状，定时投喂。定时监测水质情况，保持水温25~27 ℃，pH值7.2~7.7，溶解氧7.8~9.2 mg/L，氨氮浓度0.2 mg/L。暂养7周后，选出规格接近的400尾，随机分到16个直径0.7 m、高1.2 m、体积360 L、注水量约300 L的具有循环水装置的圆柱形养殖桶中。试验期间每日投喂两次（6：00和18：00），投饵1 h后收集桶底残饵，详细记录每缸的投料量及残饵重，并根据鳗鱼生长状况、养殖温度和水质的变化调整投喂量。水质与暂养期间一致。1.3样品采集正式试验结束后，美洲鳗鲡幼鱼禁食24 h，称重。每个养殖缸随机取8尾鱼，麻醉5~10 min（麻醉剂为丁香酚与无水乙醇按1∶9配制），使用无菌纱布擦干鱼体表面水分和黏液，尾静脉采血，4 ℃静置24 h，3 000 r/min离心10 min，取上清保存于-80 ℃冰箱，用于测定血清转氨酶活性。采血后的鳗鲡用灭菌剪刀解剖，剥离肝脏，PBS缓冲液冲洗，随机取6尾鱼的肝脏置于冻存管中经液氮速冻后保存于-80 ℃冰箱，用于测定肝脏抗氧化能力。每个重复随机取2尾鱼的肝脏保存于组织固定液中，用于制作苏木精-伊红染色切片，进行肝脏组织形态观察。1.4测定指标及方法饲料组胺水平采用比色酶法测定，试剂盒购自日本Kikkoman公司。血清中谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）指标及肝脏中总抗氧化能力（T-AOC）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、还原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）指标均使用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒进行测定，测定步骤参考试剂盒说明书。肝脏切片具体制作步骤参考许琪娅[11]的试验方法，切片在正置荧光显微镜（ECLIPSE CI，NIKON，日本）下观察并拍照。1.5数据统计与分析使用SPSS 25.0统计软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼血清转氨酶活性的影响（见图1）由图1可知，与CK组相比，H组血清AST和ALT活性升高（P0.05）。H+AST组血清AST和ALT活性均低于H组（P0.05），但与CK组比差异不显著（P0.05）。图1虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡血清转氨酶活性的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.009.F1a1（a）ALT （b） AST2.2虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏抗氧化能力的影响（见表2）由表2可知，与CK组相比，H组肝脏GSH含量、T-AOC以及SOD、CAT、GSH-Px活性均降低（P0.05），MDA含量升高（P0.05）。H+AST4组、H+AST8组肝脏GSH含量、T-AOC以及SOD、CAT、GSH-Px活性均高于H组（P0.05），MDA含量低于H组（P0.05），但与CK组相比差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.009.T002表2虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏抗氧化能力的影响组别T-AOC/(U/mg prot)SOD/(U/mg prot)CAT/(U/mg prot)GSH-Px/(U/mg prot)GSH/(mmol/g prot)MDA/(nmol/g prot)CK组0.26±0.04b131.88±6.40b43.07±4.22b167.94±5.84b189.01±7.17b1.57±0.12aH组0.18±0.02a68.19±4.68a24.47±3.21a67.42±4.86a148.40±5.65a2.71±0.13bH+AST4组0.28±0.05b116.67±6.04b38.46±3.27b166.95±7.10b195.26±8.37b1.44±0.04aH+AST8组0.27±0.03b114.88±5.21b36.63±4.82b170.41±8.26b191.68±6.33b1.46±0.08a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。2.3虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏组织形态的影响（见图2）由图2可知，与CK组相比，H组肝脏细胞界限模糊，肝小叶结构不完整，有较多肝细胞出现细胞核偏移和空泡变性现象；H+AST4组和H+AST8组肝脏细胞界限明显，呈多角形，核大而圆，位于中央清晰可见，与CK组相比无明显变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.009.F002图2虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏组织形态的影响（200×）注：A表示核偏移，B表示脂肪空泡。3讨论3.1虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼血清转氨酶活性的影响AST和ALT是评价肝脏健康和损伤程度的重要指标，主要存在于肝脏组织中，当鱼体肝脏细胞损伤时AST和ALT可被释放进入血液。本试验中，H组幼鱼血清AST和ALT活性升高，与300、500和650 mg/kg组胺使美洲鳗鲡幼鱼[5,11]、1 000 mg/kg组胺使黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）AST和ALT活性升高的研究结果类似[13]，说明饲料中高水平组胺可使美洲鳗鲡幼鱼肝脏产生损伤。H+AST组血清AST和ALT活性与CK组接近，说明虾青素可能缓解了饲料中高水平组胺对肝脏造成的损伤，这与在脂多糖胁迫下在乌鳢饲料中添加100 mg/kg虾青素降低血清转氨酶活性的研究结果类似[8]。此外，在无胁迫条件下，乌鳢饲料中添加50 mg/kg虾青素产品[14]、亚洲鲈（Lates calcarifer）饲料中添加50 mg/kg虾青素产品[15]、卵形鲳鲹饲料中添加50 g/kg雨生红球藻[16]、狮子头金鱼（Carassius auratus）饲料中添加0.8 g/kg虾青素均可显著降低血清转氨酶活性[17]。可见，在有无不利因素的胁迫条件下，在上述鱼类饲料中添加虾青素均可改善肝脏健康，可能是由于虾青素通过提高肝脏抗氧化能力降低了肝脏氧化的损伤程度[18]。此外，虾青素还可通过其极性结构渗入肝细胞膜，下调肝细胞凋亡程序基因表达，抑制肝细胞凋亡[19]。3.2虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏抗氧化能力的影响T-AOC水平是综合评价鱼体抗氧化能力的指标；SOD主要催化超氧离子自由基发生歧化反应，可将超氧阴离子转化成H2O2和O2；CAT通过催化过氧化氢分解保护细胞免受氧化损伤[20-22]；GSH-Px位于细胞质和线粒体中，可以利用GSH作为底物还原H2O2，去除酶抗氧化体系中的烷烃氢过氧化物和脂质过氧化物[23]。MDA是脂质过氧化代谢产物，其水平是评价鱼体内脂质过氧化和氧化应激水平的常用指标，可间接反映自由基对鱼体细胞的侵袭程度[24-25]。本试验中，与CK组相比，H组美洲鳗鲡幼鱼肝脏抗氧化酶活性均显著降低，MDA含量升高，与350~650 mg/kg组胺可显著降低美洲鳗鲡幼鱼肠道及肝脏抗氧化酶活性的结果类似[7,11,26]，表明在饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼抗氧化能力降低。H+AST组美洲鳗鲡幼鱼肝脏抗氧化酶活性均高于H组，MDA含量低于H组，与CK组结果接近，说明添加虾青素能够提高饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼的抗氧化能力。这与在高脂饲料胁迫下添加7.5、10.0 mg/kg虾青素提高大口黑鲈与虹鳟血清和肝脏抗氧化酶活性、降低MDA含量的研究结果类似[9-10]。此外，无胁迫条件下，添加10 mg/kg虾青素能够提高哲罗鲑（Huchotatimen）肠道总抗氧化能力[27]；添加50 mg/kg虾青素产品能够提高虹鳟血清抗氧化酶活性[28]；添加150 mg/kg虾青素产品能够提高大口黑鲈血清抗氧化酶活性，降低MDA水平[21]。其原因可能是：虾青素分子中的羟基酮和共轭双键能够提供电子或吸引自由基未配对电子，破坏氧化反应链，直接清除体内的自由基[29-31]；虾青素通过激活Nrf2的核转运上调了SOD、CAT、GSH-Px等抗氧化酶的mRNA表达量，从而提高机体抗氧化能力[20,32]。3.3虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏组织形态的影响本试验中，H组肝脏结构受损，细胞界限模糊，出现核偏移和脂肪空泡现象，与350~650 mg/kg饲料组胺使美洲鳗鲡幼鱼肝脏组织形态受损，出现脂肪空泡[11]；1 000 mg/kg饲料组胺使黄颡鱼肝脏出现炎性细胞浸润的研究结果类似[13]。H+AST组美洲鳗鲡幼鱼肝脏结构完整，与CK组无明显区别，说明添加虾青素能够改善肝脏形态结构。目前尚无关于胁迫条件下鱼类饲料中添加虾青素对肝脏形态影响的研究。但是，在无胁迫条件下，饲料中添加30 g/kg虾青素产品可减轻虹鳟肝窦充血及肝脏炎性细胞浸润[33]；添加1 g/kg虾青素产品可减轻豹纹鳃棘鲈（Plectropomus leopardus）肝窦充血及肝细胞脂肪空泡[34]；添加50 g/kg雨生红球藻产品可减轻卵形鲳鲹肝细胞脂肪空泡及炎性细胞浸润[16]。可见，虾青素具有改善肝脏形态的效果，主要作用途径为：下调了肝细胞凋亡程序启动子Caspase-9的表达，抑制肝细胞凋亡[16,35]；上调了肝脏中负责调节脂肪酸代谢的PPARα和CPT1水平，增强了脂肪酸的β-氧化，有助于减少肝脏脂肪沉积导致的空泡现象[34,36-37]；提高肝脏中抗氧化酶活力，清除细胞内自由基，减轻氧化应激对肝脏的损伤[38]；抑制肝脏中白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞介素-8（IL-8）等促炎因子表达，减轻肝脏炎性细胞浸润[33,38]。综上所述，添加虾青素显著提高了饲料组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼肝脏抗氧化能力，改善了肝脏组织形态，有益于肝脏健康。本课题组前期研究结果显示，4 mg/kg虾青素可缓解饲料组胺对美洲鳗鲡幼鱼生长的抑制作用，提高血清非特异性免疫能力，降低肠道自由基水平，提高肠道有益菌群丰度[39]。可见，添加虾青素对组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼的生长性能、肠道及肝脏健康均具有一定的改善效果。4结论本试验条件下，添加4 mg/kg虾青素即可降低组胺胁迫下美洲鳗鲡幼鱼的血清转氨酶活性及肝脏MDA含量，提高肝脏抗氧化能力，改善肝脏组织形态，有益于肝脏健康；添加8 mg/kg虾青素对美洲鳗鲡幼鱼上述指标无进一步的改善效果。