微生物制剂是从自然环境或者动物体内通过反复筛选、培养制成的有益微生物活菌制剂[1]。微生物制剂应用于水产养殖业中不仅可以促进水产动物的生长发育，提高机体免疫力，还能够通过调节水生动物肠道以及养殖水体内的菌群平衡达到促进鱼类的健康生长以及改善养殖水体环境的目的。肠道是水产动物吸收和消化的重要器官，也是水生动物第一道免疫屏障，可以起到阻碍病原菌入侵的作用[2-4]，肠道健康对水生动物的生长具有重大意义。动物肠道内寄生着大量的微生物，这些微生物会形成不同的群落，它们与宿主形成稳定的共生关系。微生物可分为有益菌和有害菌，其中有益菌能够刺激动物内源性消化酶的分泌，在肠道内定植，形成菌膜，争夺了病原菌的定植场所，有效改善肠道微环境[5-8]。硒作为机体所必需的微量元素之一，具有修复机体细胞、抗氧化、提高机体免疫力、促进生长以及预防癌症等多种作用。其中生物纳米硒稳定性更好，易被机体吸收，具有更高的稳定性和安全性[9]。目前，在水产养殖饲料中添加的微生物制剂主要包括芽孢杆菌[10]、乳酸杆菌[11]及丁酸梭菌等[12]。本试验研究了不同微生物制剂对鲫鱼生长以及肠道菌群的影响，为实际生产中复合微生物制剂饲料的开发与合理应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验动物试验用鲫鱼体重（80.73±2.43）g，由盐亭西部水产种业有限公司提供。1.1.2主要试剂微生物制剂（绵阳市农业科学研究院重点实验室）、纳米硒（绵阳市农业科学研究院重点实验室）；溶菌酶、超氧化物歧化酶和磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所）；NaCl、蛋白胨、牛肉膏、琼脂、葡萄糖、生理盐水、MS-222、酒精、革兰氏染色剂等。1.1.3试验仪器JJ124B电子天平（金博仕生物技术有限公司）、移液器（Eppendorf Research® plus）、高压灭菌锅（Systec GmbH）、HT-mini恒温培养摇床（上海赫田科学仪器有限公司）、MF43-N光学显微镜（广州市明美光电技术有限公司）、电热恒温鼓风干燥箱（吴江奥能电器设备厂）、Avanti JXN-26离心机（南京木木西里科技有限公司）、7000F水质分析仪（成都学通精科科技有限公司）、BDF-86V348超低温冰箱（博科控股集团有限公司）。1.2试验方法1.2.1试验饲料的制作试验饲料原料粉碎过80目，将乳酸杆菌和丁酸梭菌（活菌数为1.0×1010 CFU/g）用水稀释10倍，按1∶100的比例与粉碎后的饲料搅拌均匀，使用家用小型压面机压制成细面条型，40 ℃烘干，将烘干的饲料加工成颗粒饲料。1.2.2试验设计选择大小均匀的鲫鱼300尾随机分为5组，每组3个重复，每个重复20尾鲫鱼。A组饲喂添加乳酸菌制剂的饲料，B组饲喂添加丁酸梭菌制剂的饲料，C组饲喂添加乳酸菌+丁酸梭菌混合制剂的饲料，D组饲喂添加乳酸菌+丁酸梭菌混合制剂+3 mg/g的纳米硒的饲料，对照组（CK组）饲喂基础饲料。基础饲料组成及营养水平见表1，试验各组处理方法见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.T001表1基础饲料组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.0豆粕14.0粗蛋白34.51鱼粉32.0粗脂肪8.62菜粕14.0粗灰分11.02面粉28.0鱼油2.5豆油2.5微晶纤维5.0预混料2.0注：1.预混料购自成康水产有限公司。2.营养水平均为实测值。%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.T002表2试验各组处理方法组别乳酸菌/(CFU/g)丁酸梭菌/(CFU/g)纳米硒/(mg/g)CK组000A组1.0×10700B组01.0×1070C组5.0×1065.0×1060D组5.0×1065.0×10631.2.3饲养管理试验鱼驯养1个月，每天8：00和17：00各投喂1次，控制投喂量为鲫鱼体重的3%~5%。正式试验期28 d。每7 d测量一次体长和体重，并且根据体重变化调整投喂量。试验期间每天换一次水，换水量为总量的1/3左右，保持自然光照，水温24~26 ℃，溶氧浓度＞5 mg/L，pH值7.8~8.2，氨氮浓度≤0.02 mg/L，亚硝酸盐浓度≤0.2 mg/L。1.3测定指标及方法1.3.1生长性能试验开始及试验结束后，鲫鱼禁食24 h，称重，解剖分离肝胰脏、肠道，统计初重和末重，计算存活率、增重率、肥满度、饲料系数、脏体比及肝体比。存活率=(最终存活数/试验初始数)×100%(1)增重率=(末重-初重)/初重×100%(2)肥满度=体重/体长3 (3)饲料系数=饲料投喂量/(末重-初重)(4)脏体比=内脏重/体重×100%(5)肝体比=肝胰腺重/体重×100%(6)1.3.2非特异性免疫指标肝胰脏中的超氧化物歧化酶（SOD）、碱性磷酸酶（AKP）、溶菌酶（LZM）活性使用南京建成生物工程研究所的试剂盒检测，按照试剂盒说明书操作。1.3.3肠道内容物16S rRNA测序每组随机采集3尾鲫鱼的肠道内容物混样，置于-20 ℃保存，用于肠道菌群数量检测。提取鲫鱼的肠道样品的总DNA，以16S rRNA可变区V3~V4区域设计扩增引物：338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3'）/806R（5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。将鲫鱼肠道样品的扩增产物送至派诺森基因有限公司进行Illumina Misq高通量测序。对97%相似水平的可操作分类单元（OTU）代表序列进行聚类，根据聚类结果进行统计分析。在物种分类学组成层面，通过各种非监督、监督的排序、聚类和建模方法，结合相应统计学检验方法，进一步衡量不同样本间的物种丰度组成差异。1.4数据统计与分析采用SPSS 19.0软件对试验数据进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1微生物制剂对鲫鱼生长性能的影响（见表3）由表3可知，各组鲫鱼均未出现死亡的情况。A组、B组和D组鲫鱼的增重率高于对照组（P0.05）；A组鲫鱼的肥满度和饲料系数高于CK组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.T003表3微生物制剂对鲫鱼生长性能的影响组别初重/(g/尾)末重/(g/尾)增重率/%肥满度/(g/cm3)肝体比/%脏体比/%饲料系数存活率/%CK组81.00±2.3591.39±8.3112.82±1.22b2.10±0.21b2.93±0.059.46±0.352.48±0.04b100A组80.64±3.1296.02±4.6719.07±0.38a2.41±0.34a3.00±0.029.57±0.563.47±0.06a100B组80.36±2.2295.62±5.5518.98±0.74a1.98±0.12b3.26±0.049.43±0.492.37±0.03b100C组81.12±2.8991.81±5.2413.19±0.81b1.92±0.11b3.18±0.069.36±0.482.40±0.03b100D组81.17±2.3598.29±7.2921.24±1.09a1.97±0.08b3.08±0.059.44±0.432.30±0.02b100注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2微生物制剂对鲫鱼肝胰脏非特异性免疫指标的影响（见表4）由表4可知，D组鲫鱼肝胰脏SOD活性高于CK组（P0.05），A组鲫鱼肝胰脏LZM活性高于CK组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.T004表4微生物制剂对鲫鱼肝胰脏非特异性免疫指标的影响组别SODAKPLZMCK组41.37±3.90b3.83±0.152.32±0.80bA组43.22±1.30b4.02±0.702.85±0.02aB组41.75±5.95b3.78±0.182.41±0.82abC组42.75±8.52b3.89±0.182.64±0.86abD组52.75±8.52a3.92±0.182.61±0.86abU/g prot2.3微生物制剂对鲫鱼肠道菌群的影响2.3.1各组鲫鱼肠道测序量结果（见表5）由表5可知，A组样品获得去除singlton后的序列最多，共95 508条；C组获得去除singlton后的序列最少，共68 179条；CK组样品共获得81 374条去除singlton后的序列，B组共获得73 559条去除singlton后的序列，D组共获得89 163条去除singlton后的序列。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.T005表5各组鲫鱼肠道测序量结果组别同时匹配到正向和反向引物的序列量去除低质量序列后的序列量去噪后的序列量拼接后的序列量高质量序列量去除singlton后序列量CK组141 122133 687130 579122 31882 17781 374A组133 695126 536124 094118 78995 85995 508B组143 864136 824131 906118 08174 84173 559C组145 483138 342133 191119 42170 02268 179D组134 006126 666124 376119 59389 44989 163条2.3.2各组鲫鱼肠道微生物物种分类学注释结果在97%相似度水平下进行聚类，注释到了每个样品的OTU数量，见图1，各组鲫鱼肠道微生物α指数分析结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.F001图1每个样品的OTU数量10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.T006表6各组鲫鱼肠道微生物α指数分析结果组别Chao指数Shannon指数Simpson指数CK组1 468.466.620.97A组999.855.350.91B组1 953.737.330.97C组2 234.327.340.98D组866.235.060.89由图1可知，本试验样品中CK组有1 408个OTU，A组928个，B组1 925个，C组2 219个，D组821个。饲料中添加微生物制剂后明显改变了鲫鱼肠道微生物的数量。由表6可知，D组Chao指数最低，为866.23，Shannon指数最低，为5.06，Simpson指数最低，为0.89。A组和D组的Chao指数低于CK组，说明A组和D组的肠道环境更健康，可能是饲料中添加微生物制剂后抑制了肠道内有害菌的繁殖。2.4微生物制剂对鲫鱼肠道微生物物种分类单元数的影响（见图2）由图2可知，CK组鲫鱼肠道微生物共有317个分类单元，A组鲫鱼肠道微生物共有332个分类单元，B组鲫鱼肠道微生物共有396个分类单元，C组鲫鱼肠道微生物共有328个分类单元，D组鲫鱼肠道微生物最少，共有294个分类单元。饲料中添加微生物制剂后鲫鱼肠道微生物种类增多，但是加入纳米硒后反而减少，说明纳米硒的加入可能对部分肠道微生物产生了抑制作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.F002图2微生物制剂对鲫鱼肠道微生物物种分类单元数的影响2.5微生物制剂对鲫鱼肠道微生物物种分类学组成的影响（见图3）由图3可知，在属水平的分类下，鲫鱼肠道的细菌种类主要有变形菌（Proteobacteria）、放线菌（Actinobacteria）、绿弯菌（Chloroflxi）、梭杆菌（Fusobactria）、衣原体（Chlamydia）、拟杆菌（Bacteroidetes）、厚壁菌（Firmicuts）、浮游菌（Planctomycts）、软壁菌（Tnricuts）等，变形菌和放线菌是鲫鱼肠道菌群的优势菌种。A组中变形菌（62.41%）、衣原体（11.59%）和梭杆菌（9.70%）的丰度明显升高；B组中变形菌50.39%、放线菌23.31%和拟杆菌（7.79%）的丰度明显升高；C组中变形菌45.25%、放线菌23.04%和梭杆菌（8.64%）的丰度明显升高；D组中变形菌（59.84%）和放线菌（31.56%）的丰度明显升高。4个处理组中的绿弯菌丰度均明显下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.011.F003图3微生物制剂对鲫鱼肠道微生物物种分类学组成的影响3讨论3.1微生物制剂对鲫鱼生长性能的影响研究表明，添加乳酸菌能够提高饲料中干物质、粗蛋白及磷的吸收速率，调节动物的肠道菌群[13-14]，调节体内微生态平衡，抑制气单胞菌、弧菌、链霉菌等有害致病菌的生长，同时激活水生动物的免疫系统[15-16]，提高吞噬细胞和淋巴细胞的活性，增强水产生物的抗病能力及免疫力，达到预防和抵抗疾病的效果[17-19]。本试验中，饲料中添加微生物制剂后，鲫鱼肝胰脏中的LZM和SOD活性均有所提高，添加纳米硒后效果更明显，说明饲料中添加微生物制剂能够提高鲫鱼的免疫力。有研究表明，添加益生菌并不会导致血清谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性发生改变，说明饲料添加益生菌不会对鱼产生负面影响；添加益生菌可以改善鱼血清中葡萄糖与胆固醇的含量，表明添加益生菌可能会加快鱼的新陈代谢[20]。本研究发现，投喂单独添加乳酸菌的饲料后，鲫鱼的生长速度明显加快，饲料系数提高，肥满度明显提高，这可能是因为乳酸菌的代谢产物可以为鲫鱼提供营养物质，改善了鲤鱼的肠道环境，从而增强鲫鱼食欲，加快鲫鱼的生长。饲料中添加乳酸菌不仅可以促进鱼的生长，还能够提高抗病率[21]。本试验发现，投喂添加丁酸梭菌的饲料后，鲫鱼的生长速度明显加快，说明丁酸梭菌对鲫鱼的生长也具有促进作用。有研究表明，丁酸梭菌具有良好的黏附作用，且黏附后对机体细胞损伤不明显，可减少肠道内大肠杆菌的数量[22-23]。鲫鱼投喂添加乳酸菌和丁酸梭菌的配合饲料后，生长速度加快，但与对照组相比差异不明显，可能是由于乳酸菌和丁酸梭菌在鲫鱼肠道内相互竞争附着点位，肠道内菌群的状态没有达到最佳，两种益生菌的配合比例还需进一步研究。有研究报道，饲料中添加纳米硒能够升高齐口裂腹鱼的增重率和特定生长率，降低饲料系数，有效补充硒和蛋白质，改善了肌肉品质和生长性能[24]。本研究中，鲫鱼投喂添加乳酸菌、丁酸梭菌和纳米硒的饲料后，饲料系数更低，生长速度明显加快，说明加入纳米硒之后进一步提高了作用效果。3.2微生物制剂对鲫鱼肠道微生物的影响细菌定植过程通常受到多种因素的影响，如鱼卵表面、鲜活饵料和幼鱼饲养水体中的细菌[25]。POND等[26]认为，处于孵化阶段的幼鱼所需营养物质来自卵黄，其孵化后消化道发育不全，消化道内处于无菌状态，接触到水生环境及饲料时，多种细菌就会进入到肠道，最初进入到肠道的微生物适应环境后定植于肠道上皮，维持动态平衡，与鱼体形成互利共生关系，且在生长过程中优势菌群并不会随环境和其他因素发生明显的变化。本研究发现，变形菌和放线菌是鲫鱼肠道菌群的优势菌种，在投喂微生物制剂后变化不明显，推测这些优势菌群可能与鲫鱼出膜时的水环境和开口饲料相关，在苗种阶段就已经定植。饲料中添加乳酸菌的鲫鱼肠道内梭杆菌丰度明显升高；饲料中添加丁酸梭菌的鲫鱼肠道内拟杆菌丰度明显升高；4个处理组中的绿弯菌丰度均明显下降。物种丰度的指数主要包括Chao指数和Ace指数等，Chao指数和Ace指数值越大，表明物种丰度越高[27]。本试验发现，A组和D组的Chao指数低于CK组，这说明A组和D组的肠道环境更健康，更有利于鲫鱼的生长，这可能是因为饲料中添加微生物制剂后抑制了肠道内的有害菌。刘小玲等[28]研究表明，饲料中添加乳酸菌能够降低罗非鱼肠道细菌总数。类似的结果在凡纳滨对虾中也有相关的报道[29]。杨晗月等[30]研究表明，微生物制剂组小龙虾肠道内细菌生物多样性和物种丰富度均显著增加，表明小龙虾肠道菌群更趋丰富和稳定，对环境适应能力更强。饲料中添加不同种类、不同比例的微生物制剂均会对鱼类的肠道菌群产生影响，过量的丁酸梭菌会导致卵形鲳鲹幼鱼肠道微生物菌群失衡，损害其肠道健康[31]。因此，微生物制剂具体种类、比例以及用法用量还有待进一步研究。4结论饲料中添加乳酸菌、丁酸梭菌以及纳米硒可促进鲫鱼的生长，改变鲫鱼肠道微生物的群落结构，抑制肠道内有害菌的繁殖，但使用过程中需要考虑不同菌制剂之间的竞争和拮抗作用。本试验条件下的适宜组合是乳酸菌+丁酸梭菌+纳米硒。