甜高粱（Sorghum bicolor (L.) Moench）是禾本科高粱属一年生植物，在世界各地均有栽培[1-3]。甜高粱的用途较为广泛，可以产粮、产糖[4]和酿酒等[5-6]，且甜高粱具有适口性好和抗逆性强的优点，在草食畜牧业中已作为优良饲草广泛栽培与利用[7]。研究显示，甜高粱对动物机体抗氧化功能的影响，可能与其中所富含的黄酮类化合物有关[8-9]。黄酮类化合物对家畜生长性能、免疫功能及内分泌调节等均具有正向调节作用[10-12]。甜高粱中的黄酮类化合物的种类和含量主要受基因型和生长环境的影响[13]。因此，研究甜高粱不同部位中黄酮类化合物的组成和含量对其综合开发和利用具有重要意义。目前利用HPLC研究甜高粱茎秆、籽粒及全株中黄酮含量和组成的报道较少，对5种以上黄酮类化合物同时进行分离测定的方法也较为少见。因此，本研究建立同时测定甜高粱中10种黄酮类化合物含量的高效液相色谱法，比较甜高粱不同部位中黄酮类化合物的抗氧化活性，为提高甜高粱的饲用价值提供参考。1材料与方法1.1试验材料甜高粱：陇甜粱2号，2021年4—10月种植于甘肃省兰州市安宁区，于成熟期收获。取籽粒、茎秆及全株，55 ℃烘至恒重，粉碎过80目筛。甜高粱总黄酮提取物：取甜高粱籽粒、茎秆及全株，以液料比15 L/g、乙醇溶液70%、提取温度70 ℃及超声作用时间30 min为提取工艺条件，分别制备不同部位总黄酮提取物。儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、芹菜素、麦黄酮及高北美圣草素标准品购自成都标样生物科技有限公司；羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（·O2-）、DPPH自由基、ABTS+自由基、VC及BHT购自茂名市雄大化工有限公司；乙腈、甲醇（色谱纯）等购自德国默克公司；甲酸（色谱纯）购自上海麦克林生化科技有限公司；乙酸、硫酸亚铁、过硫酸钾、30%过氧化氢、水杨酸、无水乙醇购自天津市光复精细化工有限公司；纯净水购自屈臣氏。1.2仪器设备1525型高效液相色谱仪（美国Waters公司），TD52型离心机（上海京灿精密机械有限公司），1850a型摩尔超纯水机（重庆摩尔水设备处理公司），SQP型电子分析天平（赛多利斯科学仪器有限公司），RE-5015L型旋转蒸发仪（上海越众仪器设备有限公司）。1.3试验方法1.3.1供试品溶液制备精密称取甜高粱不同部位总黄酮提取物0.2 g，溶于80%甲醇配制成0.2 g/L供试品溶液。1.3.2对照品溶液制备精密称取儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、高北美圣草素、芹菜素及麦黄酮标准品适量，以80%甲醇溶液溶解配制成标准品母液，其浓度为10 g/L，继续配制0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 g/L的标准品混合对照液。1.3.3检测条件SUNFIRE-C18色谱柱（150 mm×4.6 mm，5 µm）；流动相A为甲酸-水（2∶1 000），B相为甲酸-乙腈（1∶1 000）；流速：1.2 mL/min；紫外检测波长280 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。流动相梯度洗脱程序见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.T001表1流动相梯度洗脱程序序号洗脱时间/min流速/(mL/min)流动相A/%流动相B/%101.29822301.275253520.860404551.29825581.29821.3.4线性关系考察取混合对照品溶液，逐级稀释，按1.3.3条件进行测定，进行5个不同浓度的线性关系考察，通过线性回归分析，得到10种标准品的回归方程。1.3.5精密度试验精密吸取混合对照品溶液，按照1.3.3色谱条件重复进样6次，测定峰面积的RSD值。1.3.6重复性试验精密称取1.3.1中同一供试品样品0.2 g，制备6份平行供试品溶液，按照1.3.3色谱条件，测定峰面积的RSD值。1.3.7稳定性试验精密称取1.3.1中同一供试品样品0.2 g，按照1.3.3色谱条件，分别在0、4、8、12、24 h进行测定，计算各组分峰面积的RSD值。1.3.8加标回收率试验精密称取已知含量的供试品样品，平行制备6份供试品溶液，分别加入一定量的混合对照品溶液，按照1.3.3色谱条件进行测定，计算平均回收率和RSD值。1.3.9黄酮类化合物含量测定分别精密称取3份1.3.1中同一供试品样品0.2 g，不同部位分别平行制备3份供试品溶液，按照1.3.3色谱条件进行测定，计算不同部位10种黄酮类化合物含量。1.4甜高粱不同部位总黄酮提取物抗氧化能力评价精密称取已知含量的甜高粱不同部位提取物供试品、对照品VC和BHT，配制成100 g/L的样品和对照品溶液，依次逐级稀释成不同浓度（0.01、0.05、0.10、0.20、0.50、1.00 g/L）的样品和对照品溶液。当抑制率为50%时，概率单位为5。将5代入回归方程，可求得抑制率为50%时化合物浓度的对数。将浓度对数转化为浓度（使用函数POWER），即为半抑制浓度（IC50）。1.4.1·OH自由基清除率的测定·OH自由基的生成主要由Fenton反应产生。参照KANWAL等[14]和ZHUA等[15]的方法略加修改，在562 nm处测定吸光度，每个浓度平行测定3次，以VC和BHT为阳性对照，计算·OH自由基清除率。·OH自由基清除率=A0-AiA0×100%(1)式中：A0为空白对照品吸光度，Ai为样品溶液吸光度。1.4.2·O2-自由基清除率的测定采用YANG等[16]的方法并加以修改，试管中加入0.05 mmol/L Tris-HCl缓冲液（pH值8.2）5 mL、25 ℃水浴反应20 min，分别加入1 mL不同浓度的样品溶液，加入25 ℃预热的3 mmol/L邻苯三酚溶液0.5 mL混匀。于25 ℃水浴中反应5 min，加入8 mmol/L HCl终止反应，在299 nm处测定吸光度，记为Ai；空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品溶液测定吸光度，记为A0；以0.5 mL的蒸馏水代替邻苯三酚溶液测定各浓度下的吸光度，记为Aj。以VC和BHT为阳性对照，计算清除率。·O2-自由基清除率=1-Ai-AjA0×100% (2)1.4.3DPPH自由基清除率的测定采用LI等[17]的方法并改进，向2 mL样品溶液中分别加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，混匀。避光静置反应60 min，在517 nm处测定吸光度，记为Ai；取2 mL不同浓度的样品于试管中分别加入70%的乙醇溶液2 mL，混匀后避光静置反应60 min，在517 nm处测定吸光度，记为Aj；取70%的乙醇溶液2 mL，加入0.2 mmol/L DPPH溶液2 mL，混匀后避光静置反应60 min，在517 nm处测定吸光度，记为A0。以VC和BHT为阳性对照，计算清除率。DPPH自由基清除率=1-Ai-AjA0×100% (3)1.4.4ABTS+自由基清除率的测定采用FAN等[18]方法并加以修改，计算ABTS+自由基阳离子的消失量，测定ABTS+自由基清除率，蒸馏水为空白样品。以VC和BHT为阳性对照，计算清除率。ABTS+自由基清除率=A0-A1A0×100% (4)式中：A0为空白对照品的吸光度，A1为供试品溶液的吸光度。1.4.5总还原能力（FRAP）的测定使用FRAP分析评估总抗氧化能力[19]。1.5数据统计与分析采用SPSS 21软件对数据进行单因素方差分析，并对甜高粱不同部位总黄酮提取物含量与抗氧化活性进行Person相关性分析，相关因子R≥0.900，表明相关性良好。每组平行重复测定3次，结果以“平均值±标准差”表示。采用Origin 2021pro和Excel 2016软件绘图。2结果与分析2.1色谱条件的优化2.1.1流动相选择本试验比较了甲酸-水、甲酸-乙腈、甲醇-水-冰醋酸[20]、甲醇-水-冰醋酸[21]、乙腈-甲酸水[22]和乙腈-磷酸水作为流动相的分离效果和出峰时间等因素，且参照中国药典2020年版[23]，通过优化梯度洗脱程序。结果表明，流动相：A相为甲酸-水（2∶1 000）、B相为甲酸-乙腈（1∶1 000）进行梯度洗脱时，10种黄酮类化合物与其他成分达到基线分离且分离度较好，见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.F001图1各化合物HPLC图注：标记的峰1~10分别为儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、高北美圣草素、芹菜素及麦黄酮，A混标。2.1.210种黄酮类化合物的线性关系（见表2）由表2可知，10种黄酮类化合物在其对应的浓度范围内呈现良好的线性关系。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.T002表210种黄酮类化合物的线性关系项目回归方程R2线性范围/(mg/L)儿茶素Y=3.62×106X+3.96×1030.999 950~1 000氯化芹菜定Y=1.67×107X+1.13×1030.999 92~100花旗松素Y=1.41×107X+1.48×1040.999 710~200芦丁Y=4.29×106X-9.46×1040.998 61~1 000槲皮素Y=6.11×106X+4.52×1030.999 910~200木犀草素Y=1.01×107X+6.30×1040.999 550~1 000柚皮素Y=2.23×107X-3.79×1040.999 610~200高北美圣草素Y=1.13×107X+3.35×1040.998 41~200芹菜素Y=7.04×106X+4.13×1040.999 22~200麦黄酮Y=6.13×106X+1.47×1050.999 150~1 0002.1.3精密度试验精密吸取混合对照品溶液，重复进样6次，得到儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、高北美圣草素、芹菜素及麦黄酮10种化合物峰面积的RSD值分别为0.10%、0.90%、0.97%、0.98%、0.11%、0.13%、1.00%、0.98%、0.96%和0.95%（n=6），说明仪器精密度良好。2.1.4重现性试验精密称取1.3.1中同一供试品样品0.2 g，平行制备6份供试品溶液，得到儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、高北美圣草素、芹菜素及麦黄酮10种化合物平均含量的RSD值分别为1.41%、0.21%、1.27%、0.32%、1.11%、0.83%、1.52%、0.44%、0.56%和1.95%（n=6），说明本方法重复性良好。2.1.5稳定性试验精密称取1.3.1中同一供试品样品0.2 g，分别在室温下放置0、4、8、12、24 h进行测定，得到儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、高北美圣草素、芹菜素及麦黄酮10种化合物峰面积的RSD值分别为0.24%、1.31%、0.27%、0.54%、1.66%、1.23%、1.85%、0.76%、2.35%和1.70%，说明样品溶液在室温下24 h内基本稳定。2.1.6加标回收率试验精密称取已知含量的供试品样品，平行制备6份供试品溶液，分别加入一定量的含儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素、木犀草素、柚皮素、高北美圣草素、芹菜素及麦黄酮的混合对照品溶液，得到平均回收率，结果见表3。由表3可知，10种化合物平均回收率分别为99.2%、96.5%、95.0%、98.6%、97.8%、97.9%、102.6%、98.9%、105.8%和96.9%，表明加标回收率良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.T003表310种化合物加标回收率试验结果（n=6）项目样品中含量/mg加入量/mg平均回收率/%RSD/%儿茶素0.220 00.216 099.21.03氯化芹菜定0.019 20.015 596.52.22花旗松素0.054 40.049 995.01.19芦丁0.161 00.158 098.61.69槲皮素0.056 70.050 297.82.56木犀草素0.318 00.299 097.91.96柚皮素0.047 60.038 8102.62.86高北美圣草素0.010 40.097 598.92.24芹菜素0.028 10.025 9105.81.92麦黄酮0.366 00.357 096.91.052.2甜高粱不同部位总黄酮提取物中黄酮类化合物含量黄酮类化合物作为植物中广泛存在的次级代谢产物[24-26]。甜高粱中的黄酮类化合物含量和积累特性与植物的色泽、品质及营养价值直接相关[27-28]。分别精密称取3份甜高粱不同部位同一样品0.2 g，利用外标法计算出10种黄酮类化合物的含量，结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.T004表4甜高粱不同部位总黄酮提取物中黄酮类化合物含量（n=3）项目茎秆籽粒全株儿茶素0.556 9±0.020 0b3.557 8±0.020 0a0.303 0±0.020 0c氯化芹菜定0.110 1±0.030 0a0.011 2±0.010 0b0.009 6±0.010 0b花旗松素0.001 8±0.010 0c0.111 4±0.020 0a0.044 1±0.020 0b芦丁0.265 9±0.020 0b2.114 6±0.040 0a0.305 8±0.090 0b槲皮素0.035 0±0.010 0c0.089 5±0.010 0b0.147 9±0.030 0a木犀草素0.194 0±0.030 0a—0.025 4±0.010 0b柚皮素0.017 0±0.010 0a0.017 0±0.010 0a0.033 0±0.020 0a高北美圣草素——1.843 0±0.330 0a芹菜素——0.257 4±0.060 0a麦黄酮——0.122 5±0.030 0a注：1.“—”表示含量低于检测限。2.同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mg/g2.3甜高粱不同部位总黄酮提取物抗氧化能力评价2.3.1甜高粱不同部位总黄酮提取物对·OH自由基清除率的影响（见图2）由图2可知，甜高粱不同部位总黄酮提取物对·OH自由基的清除率随着不同部位总黄酮提取物浓度增加均呈逐渐上升的趋势。当提取物浓度在1.00 g/L时，籽粒、全株及茎秆清除率分别为55.28%、48.39%和38.59%，达到同浓度下BHT对·OH自由基清除率的72.80%、63.70%和50.80%。籽粒、全株及茎秆中所含黄酮类化合物分别为6、10、7种，而在各浓度下其清除率均表现为籽粒全株茎秆，说明甜高粱不同部位中共有的儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素及柚皮素对·OH自由基的清除起主要作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.F002图2甜高粱不同部位总黄酮提取物对·OH自由基清除率的影响2.3.2甜高粱不同部位总黄酮提取物对·O2-自由基清除率的影响（见图3）由图3可知，随着总黄酮提取物浓度的增加，甜高粱籽粒和全株对·O2-自由基的清除作用不断增强，甜高粱茎秆总黄酮浓度为0.50 g/L时清除率趋于平稳。当提取物浓度在1.00 g/L时，籽粒、全株及茎秆清除率分别为籽粒57.55%、52.82%和31.85%，达到同浓度下VC对·O2-自由基清除率的66.7%、61.2%和36.9%。在不同浓度下对·O2-自由基清除率依然均表现为籽粒全株茎秆，说明甜高粱不同部位中共有的儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素及柚皮素对·O2-自由基的清除起主要作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.F003图3甜高粱不同部位总黄酮提取物对·O2-自由基清除率的影响2.3.3甜高粱不同部位总黄酮提取物对DPPH自由基清除率的影响（见图4）由图4可知，与VC和BHT相比，当提取物浓度增加，甜高粱籽粒的DPPH自由基清除率明显提升，总黄酮提取物浓度为1.00 g/L时，其DPPH自由基清除率高于VC和BHT。当提取物浓度在1.00 g/L时，籽粒、全株及茎秆对DPPH自由基清除率分别为103.31%、85.05%和66.02%，籽粒对DPPH自由基清除率均超过同浓度下VC（98.66%）和BHT（96.35%）。在不同浓度下对DPPH自由基的清除率表现为籽粒全株茎秆，说明甜高粱籽粒中总黄酮提取物具有较强的清除DPPH自由基的能力。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.F004图4甜高粱不同部位总黄酮提取物对DPPH自由基清除率的影响2.3.4甜高粱不同部位总黄酮提取物对ABTS+自由基清除率的影响（见图5）由图5可知，随着不同部位甜高粱总黄酮提取物浓度的增大，籽粒、全株及茎秆对ABTS+自由基清除率明显增强。当黄酮提取物浓度高于0.01 g/L时，三者对ABTS+自由基清除率低于VC与BHT。当提取物浓度高于0.05 g/L时，籽粒对ABTS+自由基的清除率高于全株和茎秆；当提取物浓度为1.00 g/L时，籽粒、全株及茎秆清除率分别为64.71%、53.17%和45.92%，籽粒达到同浓度下VC对ABTS+自由基清除能力的82.1%。在不同浓度下对ABTS+自由基的清除率仍为籽粒全株茎秆。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.F005图5甜高粱不同部位总黄酮提取物对ABTS+自由基清除率的影响2.3.5甜高粱不同部位总黄酮提取物的FRAP（见图6）由图6可知，提取物浓度在0.01 g/L时，籽粒、全株及茎秆提取物的还原能力与VC和BHT相当，且在不同浓度下三者总还原能力均表现相当。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.F006图6甜高粱不同部位总黄酮提取物的FRAP综合图2~图6与表4可知，甜高粱不同部位总黄酮提取物的抗氧化活性可能与其不同部位黄酮类化合物的含量相关。2.3.6甜高粱不同部位总黄酮提取物的IC50（见表5）由表5可知，除FRAP还原能力的IC50显示为茎秆＞籽粒＞全株外，其余依然表现为籽粒全株茎秆。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.T005表5甜高粱不同部位总黄酮提取物的IC50项目·OH自由基·O2-自由基DPPH自由基ABTS+自由基FRAPVC0.118 20.086 90.046 50.148 60.000 6BHT0.114 90.195 80.052 30.135 60.006 6茎秆2.398 34.587 00.445 81.513 60.003 8籽粒0.544 20.436 10.143 80.453 70.017 8全株1.093 50.852 20.239 30.841 20.019 8g/L2.4甜高粱不同部位总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析黄酮类化合物因其具有抗氧化[29-30]、抗炎、抗菌等重要生理功能，其药理活性已成为当下研究的热点[31-33]。为深入了解甜高粱不同部位总黄酮提取物含量与其抗氧化能力的关系，对甜高粱不同部位总黄酮提取物含量与抗氧化活性进行相关性分析，结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.022.T006表6甜高粱不同部位总黄酮含量与抗氧化活性相关性分析项目·OH自由基清除率·O2-自由基清除率DPPH自由基清除率ABTS+自由基清除率FRAP还原能力茎秆0.805**0.811**0.935**0.925**0.471籽粒0.843**0.876**0.950**0.931**0.972**全株0.840**0.907**0.940**0.915**0.398注：“*”表示显著相关（P0.05）；“**”表示极显著相关（P0.01）。由表6可知，相关因子R≥0.900，表明相关性良好。在P0.01水平上，茎秆和籽粒的总黄酮提取物含量与·OH自由基和·O2-自由基清除率及全株的总黄酮提取物含量与·OH自由基清除率的相关性略低。茎秆和全株的总黄酮提取物含量与FRAP还原能力的相关性不显著。其余部位的总黄酮提取物含量与抗氧化能力之间的相关系数均大于0.900，具有极显著的正相关关系（P0.01）。3结论本试验建立了同时测定甜高粱不同部位中10种黄酮类化合物含量的高效液相色谱法，该方法简便，精密度、稳定性、重复性及加标回收率均符合分析要求，可用于甜高粱中黄酮类化合物的含量测定。体外抗氧化结果表明，甜高粱籽粒、全株及茎秆中所含黄酮类化合物为6、10、7种，在不同浓度时对自由基的清除率持续表现为籽粒全株茎秆，说明甜高粱不同部位中共有的6种黄酮类化合物（儿茶素、氯化芹菜定、花旗松素、芦丁、槲皮素及柚皮素）主要起抗氧化作用。