黄酮类化合物是苜蓿重要的次生代谢物之一，具有抗肿瘤、抗炎、抗氧化、抗病毒和抗菌等多种生物活性[1]。黄酮类化合物可以提高动物的生长性能，预防和治疗疾病，减少甲烷生成[2]。如何更高效地提取苜蓿中的黄酮类化合物，仍是当前亟待解决的问题。本文综述了苜蓿黄酮的多种提取方法，为黄酮类化合物提取工艺的选择和优化提供借鉴，也为苜蓿黄酮在饲料添加剂和兽药等领域的应用奠定基础。1苜蓿黄酮的提取方法苜蓿黄酮的传统提取方法设备简单、成本低，但溶剂量大、用时长、能耗高。非传统方法采用现代、生态的方法，提取时间短，但设备昂贵、复杂。超声提取（UE）是基于机械波的传播，使温度和压力改变，产生空化气泡，它们在机械波的压缩-稀疏循环中崩溃，爆破时会导致植物材料破裂，从而促进提取物的释放[3]。目前，超声提取是苜蓿黄酮提取的主要方法，其主要工艺参数见表1[4-12]，其他常用提取方法见表2[13-18]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.030.T001表1苜蓿黄酮超声提取法序号试验设计最优工艺含量/提取率文献来源1单因素液料比30 mL/g、乙醇浓度70%、时间30 min、功率180 W4.893 mg/g韩洲庆等[4]2均匀设计液料比19 mL/g、提取2次、时间128 min、乙醇浓度71%34.200 mg/g孙海峰等[5]3正交乙醇浓度40%、温度40 ℃、液料比50 mL/g、时间60 min6.220 mg/g魏伯平等[6]4正交液料比30 mL/g、时间30 min、50 ℃、酶解时间1 h0.040 g/L胡桂莲[7]5正交乙醇浓度70％、提取温度60 ℃、时间30 min、功率180 W6.430 mg/g许英一等[8]6正交液料比20 mL/g、温度70 ℃、乙醇浓度70％0.024 g/L尹卫等[9]7响应面丙酮浓度50%、液料比20 mL/g、时间45 min、温度60 ℃15.760 mg/gWU等[10]8响应面乙醇浓度68%、液料比35 mL/g、时间60 min1.764 mg/g赵娅敏等[11]9响应面液料比40 mL/g、时间55 min、温度60 ℃9.928 mg/g施伟梅等[12]10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.030.T002表2苜蓿黄酮其他常用提取方法提取方法试验设计最优工艺含量/提取率参考文献微波提取正交时间30 min、乙醇浓度70%、功率600 W、液料比25 mL/g、温度80 ℃9.040%黄晓慧等[13]微波提取正交乙醇浓度40%、pH值10.00、液料比50 mL/g、功率140 W、时间30 s6.220 mg/g张羽男等[14]酶法单因素果胶酶2.7%、温度57 ℃、pH值5.4332.580 µg/gRAFIŃSKA等[15]酶法响应面pH值6.00、酶浓度2.96%、时间58.92 min、温度38.96 ℃546.000 µg/gKryachko等[16]索式提取单因素液料比30 mL/g、乙醇浓度70%、时间3 h、温度90 ℃9.480 mg/g李晨阳等[17]浸提法正交温度90 ℃、时间4 h、液料比40 mL/g5.862 mg/g周萍芳等[18]2黄酮类化合物的功能及作用机制2.1抗氧化大多数黄酮类化合物以糖苷形式出现，其结构中糖的连接数量和位置会影响黄酮类化合物的抗氧化性能[19]。糖苷形式的类黄酮在肠道中会被酶水解和吸收，通过上皮细胞和肝脏中的Ⅱ相酶与葡萄糖醛酸或硫酸盐结合，在小肠中以乳糖酶根皮苷水解酶或细胞质β-葡萄糖苷酶形成的多酚苷元被吸收，并发生葡萄糖化、磺化和甲基化反应[20]。类黄酮的抗氧化能力取决于其官能团的类型及在核结构周围的排列[21]，邻苯二酚B环中羟基的数量和位置及其在吡喃C环上的位置会影响自由基的清除能力[22]。羟基可以通过共振向自由基提供电子和氢，产生相对稳定的类黄酮自由基[23]。类黄酮的抗氧化作用机制包括直接清除活性氧（ROS），通过金属螯合抑制ROS的形成以及激活抗氧化防御系统[24]。2.2抗炎炎症涉及炎症触发因子诱导的特定信号，募集具有吞噬特性的先天免疫细胞。这些先天免疫细胞能够吸引淋巴细胞并引发免疫反应[25]。黄酮类化合物可通过多种途径发挥抗炎作用，如抑制调节酶和转录因子等。黄酮类化合物能够影响炎症过程中几种重要的免疫细胞和免疫机制，如蛋白激酶和转录因子的抑制、磷酸二酯酶的抑制以及对免疫细胞的影响等[26]。2.3抗病毒截至2020年5月，研究人员已在不同病毒中测试了100多种天然黄酮类化合物的1 000多项体内外抗病毒活性[27]。黄酮类化合物抑制病毒的机制主要包括：阻碍病毒附着和进入细胞；阻碍病毒DNA复制、蛋白质翻译和多蛋白加工的不同阶段；抑制病毒被释放以侵入其他健康的宿主细胞[28]。黄酮类化合物抗病毒作用的分子机制主要在于抑制病毒神经氨酸酶、蛋白酶和DNA/RNA聚合酶，以及修饰各种病毒蛋白[29]。2.4抗菌黄酮类化合物与ATP分子的结构相似，可以与ATP结合位点结合，从而抑制靶酶的活性。黄酮类化合物的主要抗菌机制是通过抑制核酸合成、防止细胞质膜功能和抑制细胞代谢等进行[30]。一些黄酮类化合物的合成衍生物对革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌的抑菌活性比标准药物高20~80倍[31-32]。2.5免疫调节黄酮类化合物具有免疫调节作用[33]。黄酮类化合物的免疫调节机制主要包括：通过上调相关激活受体增强NK细胞活性，内吞作用和趋化作用促进T细胞活化；抑制中性粒细胞的氧化爆发和M1型巨噬细胞的活化，促进M1向M2的转化；在不同的条件下对B细胞表现抑制或激活作用[34]。3苜蓿黄酮在动物生产中的应用3.1苜蓿黄酮在反刍动物生产中的应用苜蓿黄酮具有杀菌、抗氧化和增强机体免疫力等生物活性功能[35]。饲粮中添加60 mg/kg苜蓿黄酮可以改变牛奶的成分，且乳中总固形物含量随苜蓿黄酮添加量的增加呈线性下降[36]。苜蓿黄酮能够通过调节瘤胃中的微生物种群，提高营养物质的消化率，门属数量随添加量的增加呈线性增加[37]。苜蓿黄酮能够提高奶牛的采食量，调节机体免疫力，抑制细胞凋亡，提高细胞活性，促进乳蛋白和乳糖的合成，但对乳脂合成几乎无影响[38]。添加0.4%、0.6%和0.8%苜蓿总黄酮组奶牛体外瘤胃发酵液的24 h产气量大于1.0%、1.2%和对照组，其中0.8%组氧化还原电位及总挥发性脂肪酸（TVFA）、乙酸的含量分别达到271 mV、114.87 mmol/L和64.43 mmol/L[39]。苜蓿黄酮具有雌激素作用，能够提高奶牛的泌乳性能，添加75 mg/L苜蓿黄酮时，奶牛乳腺上皮细胞内乳酸脱氢酶活性达到1 138.04 U/L，谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性达到434.6 U/mL，丙二醛（MDA）含量为1.76 μmol/L[40-41]。邓培华[42]研究发现，黄酮类化合物具有弱/抗雌激素样作用的双重特性，可根据动物内源性雌激素水平和受体的数量，激活或拮抗内源性雌激素活性，通过对神经内分泌的调控作用实现调节动物生长。在饲粮中添加苜蓿黄酮对绵羊血清中MDA含量没有显著影响，总抗氧化能力（T-AOC）和总超氧化物歧化酶（T-SOD）活性呈上升趋势，GSH-Px活性显著升高，与剂量呈正相关，说明苜蓿黄酮能够提高绵羊的抗氧化性能[43]。王梦竹[44]研究发现，饲粮中添加不同水平苜蓿黄酮对绵羊血液中球蛋白（GLB）、尿素氮（BUN）、高密度脂蛋白（HDL）和磷（P）含量有显著影响，对肝脏功能无不良影响。苜蓿和红车轴草黄酮提取物也可以调节绵羊血液抗氧化指标、激素指标和部分生化指标，提高肉羊的日增重[45]。王洋等[46]发现，在基础饲粮中添加20 mg/kg苜蓿提取物，羊肉的GSH-Px、超氧化物歧化酶（SOD）活性及亚麻酸、多不饱和脂肪酸含量分别达到了118.04 U/mg、2.61 U/mg、5.34 mg/kg和27.4 mg/kg，羊肉硬脂酸含量从15.56 mg/kg降低至10.05 mg/kg。3.2苜蓿黄酮在家禽生产中的应用饲粮中加入15 mg/kg苜蓿黄酮可使0~21、0~42日龄肉鸡平均日增重分别由50.78、55.12 g提高至51.65、57.81 g，总胆固醇含量降低，血清HDL、SOD、过氧化氢酶（CAT）、T-AOC和GSH-Px水平增加，血清MDA含量降低[47]。CHEN等[48]研究显示，添加苜蓿黄酮使肉鸡的T-AOC、SOD和GSH-Px活性分别提高了3.89%~24.49%、0.53%~7.39%和0.79%~11.79%，MDA水平下降了0.47%~18.27%，料重比降低了2.98%~16.53%，肉鸡存活率显著提高。饲粮中添加苜蓿黄酮，崇仁麻鸡的平均日增重由32.44 g提高至33.50 g，提高了3.27%，料重比由2.92降低至2.75，降低了5.82%，皮下脂肪厚度降低了26.22%，肌间脂肪宽度降低了20.53%，添加0.10％的苜蓿黄酮较为适宜[49]。熊小文等[50]研究发现，添加苜蓿黄酮后，崇仁麻鸡母雏平均日采食量提高了5.8%，体重（15 d）和日增重（15~21 d）也得到显著提高，料重比降低了1.7%。周萍芳[51]发现，添加300 mg/kg的苜蓿黄酮能够使麻鸡的平均体重增加4.5%，平均日增重增加7.4%，麻鸡对钙的消化率提高8.5%；添加300、450 mg/kg的苜蓿黄酮可降低血脂、尿素氮和尿酸含量；添加150 mg/kg苜蓿黄酮能够增强麻鸡的免疫功能，提高脾脏指数和法氏囊指数。在饲粮中添加苜蓿黄酮提取物可以改善扬州鹅的生长性能和部分生理、生化指标，增加胸肌重、胸肌率和腔骨重；使腺胃和肌胃pH值比对照组降低了10.6%和10.9%，增加了十二指肠、空肠及回肠的长度与重量，促进了肠道的发育，提高了胸肌和腿肌的肌苷酸含量以及嫩度[52-53]。3.3苜蓿黄酮在猪生产中的应用在基础饲粮中添加0.10%和0.15%的苜蓿黄酮可以使生长育肥猪背最长肌的剪切力降低13.94%和14.19%，滴水损失降低23.79%和23.39%，肉色亮度（L*值）提高12.60%和10.68%，表明苜蓿黄酮能够改善肌肉嫩度，维持肉色稳定性[54]。苜蓿黄酮对断奶仔猪的生长性能和免疫性能具有一定的影响。添加0.4%苜蓿黄酮可提高断奶仔猪肝脏抗氧化性能；苜蓿黄酮对断奶仔猪结肠细菌的丰度具有显著影响，而对细菌的多样性无显著影响，其中添加0.1%苜蓿黄酮可提高结肠内细菌相对丰度，改变断奶仔猪结肠群落组成及结构[55-56]。苜蓿黄酮具有良好的抗氧化作用，添加量为0.02%时对猪脂肪效果较好[57]。饲粮中添加适宜剂量的苜蓿黄酮在促进动物生长发育、增强机体免疫力、改善肠道健康和繁殖性能、治疗乳房炎、改善乳品质和肉品质等方面均有显著效果[58]。体外试验表明，苜蓿黄酮对大肠杆菌的最小抑菌浓度（MIC）为0.15 g/L，对金黄色葡萄球菌的MIC为0.20 g/L，表明苜蓿黄酮对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑制能力[59]。4结论苜蓿黄酮具有抗菌、抗病毒和抗氧化等多种特性，是抗生素的潜在替代品之一，能够提高动物的生长性能及免疫力，改善胃肠道形态、胴体特征和血液生化指标，减少氧化应激，降低死亡率，在畜牧业中的应用前景广阔。