地西泮，又名安定，具有抑制中枢神经系统的功能，主要用于治疗焦虑和镇静催眠[1-3]，在人类临床和兽医临床中广泛应用[4-5]。长时间食用有地西泮残留的水产品会使人头晕[6]。《食品安全国家标准 食品中兽药最大残留限量》（GB 31650—2019）[7]规定，地西泮不得在动物性食品中检出。近年来，不同地区多种淡水水产品，如鲢、鳙及鲤等均有检出地西泮残留的报道[8-10]。地西泮在水产品中频繁检出，但其污染源头尚不明确。杨光昕等[11]推测鱼饵中高浓度的地西泮可促使周边的鱼聚集和进食，从而达到快速捕鱼的效果，并对市售35个鱼饵样品进行分析，发现地西泮检出率为40%，含量高达82 214 μg/kg。鱼饵中高浓度的地西泮导致水产养殖场所被污染，同时地西泮在环境中的代谢周期较长[12]，增加了养殖水产品被污染的风险[13]。因此，本试验利用液相色谱-串联质谱联用仪建立了鱼饵中地西泮含量的检测方法，分析了鱼饵中地西泮检测方法的测量结果不确定度，为鱼饵中地西泮残留检测过程质量评价提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂地西泮标准品（浓度为100 mg/L，纯度≥99.9%，天津阿尔塔科技有限公司），N-丙基乙二胺吸附剂、氯化钠、十八烷基键合硅胶吸附剂（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），乙腈、乙酸乙酯、甲酸铵、甲酸、甲醇（色谱纯，美国Thermo公司），试验用鱼饵（杭州当地市场）。1.2仪器设备LC-MS/MS 8050液相色谱-串联质谱联用仪（日本岛津公司），BSA224S电子天平（精度为0.01 g，德国Sartorius公司），EUFO-945616涡旋混合器（美国TALBOYS公司），ST16R高速冷冻离心机（美国Thermo公司），CT15RE小型台式冷冻离心机（日本HITACHI公司），Auto EVA-60全平行浓缩仪（睿科仪器有限公司），Milli-Q超纯水仪（法国Millipore公司）。1.3试验方法试验参考了食品和水体等基质中地西泮残留的检测方法[14-16]，建立了鱼饵中地西泮的检测方法。称取鱼饵试样2 g（精确至0.01 g），置于50 mL离心管中，加入2 mL水，涡旋混匀3 min，使鱼饵散布于水中，加入5 mL乙酸乙酯作为提取液，涡旋混匀5 min，加入1 g氯化钠，以增加水相层密度，继续涡旋3 min，4 ℃、5 000 r/min离心8 min。将乙酸乙酯层移至25 mL玻璃试管中，加入5 mL乙酸乙酯于剩余混合物中再次提取（不再加入氯化钠）。合并乙酸乙酯提取液，40 ℃下氮吹至近干（或仅剩油脂）。加入2 mL 80%乙腈-水溶液溶解残渣，加入100 mg N-丙基乙二胺吸附剂和100 mg十八烷基键合硅胶吸附剂，涡旋混合10 min，转移至2.5 mL离心管中，4 ℃、12 000 r/min离心3 min，使用0.22 μm有机滤膜过滤上清液。1.4液相色谱条件色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 μm），进样量为5 μL，柱温40 ℃，流速0.35 mL/min。流动相A为0.1%甲酸水（含2 mmol/L甲酸铵），流动相B为0.1%甲酸乙腈。流动相洗脱梯度见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T001表1流动相洗脱梯度步骤时间/min流动相A/%流动相B/%1095520.5059530.8059540.8159552.005951.5质谱分析方法使用三重四极杆质谱仪，电喷雾离子源，采用正离子扫描模式。监测方式为多反应监测，接口温度为350 ℃，脱溶剂温度为602 ℃，脱溶剂管温度为250 ℃，雾化气流量为3.00 L/min，加热气流量为10.00 L/min，干燥气流量为10.00 L/min。质谱参数见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T002表2质谱参数保留时间/min母离子质荷比子离子质荷比Q1 Pre偏差/V碰撞能量/eVQ3 Pre偏差/V1.35285.10193.15*-30.0-31.0-20.01.35285.10154.10-30.0-28.0-29.0注：“*”表示为定量离子。2结果与分析2.1建立数学模型试验建立了鱼饵中地西泮含量测定的数学模型，如式（1）所示。ω=c×Vm (1)式中：ω为试样中地西泮含量的质量分数（μg/kg），c为试样中地西泮的质量浓度（μg/L），V为试样溶液定容体积（mL），m为试样的质量（g）。2.2不确定度的来源分析本文参考兽药残留检测中的不确定的评定方法[17-19]，分析影响试样中地西泮含量测定结果的各个不确定度来源，鱼饵中地西泮含量测定不确定度来源见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.F001图1鱼饵中地西泮含量测定不确定度来源由图1可知，引入的不确定度来源主要有试样称量时天平引入的不确定度，复溶后定容引入的不确定度，地西泮标准品纯度引入的不确定度，标准工作曲线线性拟合时产生的不确定度，标准工作溶液配制过程中使用量器引入的不确定度，试样重复测量产生的不确定度，检测仪器引入的不确定度。2.3各因素的不确定评定2.3.1试样称量引入的不确定度鱼饵试样称样量为2 g，所用电子天平的最大称样量为220 g，最小读数为0.01 g，查询《电子天平》（JJG 1036—2022）检定规程[20]，可知电子天平最大允许误差为±0.05 g，按照矩形分布（B类评定）[21]，K=3。使用电子天平称量引起的不确定度需计算2次，一次为去皮，一次为样品称重，则由电子天平误差引起的不确定度为：um=0.053=2.89×10-4 g。相对标准不确定度为：urelm=(umm)2×22=2.04%。2.3.2复溶引入的不确定度样品前处理过程中，加入2.0 mL的80%乙腈-水溶液复溶，使用1 mL移液器2次，查询《移液器》（JJG 646—2006）检定规程[22]，可知其最大允许误差为±1.0%，按照矩形分布K=3，其相对标准不确定度为:urelV=(1.0%3)2×2=0.82%。2.3.3标准溶液引入的不确定度（1）标准品纯度引入的不确定度。地西泮标准品浓度为100 mg/L，纯度≥99.9%，由地西泮标准品证书得知其不确定度为3%，按矩形分布K=3，标准品纯度引入的相对标准不确定度为：urelCs=3%3=1.73%。（2）标准工作溶液配制引入的不确定度。地西泮标准中间液和标准工作溶液浓度及配制方法见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T003表3地西泮标准中间液和标准工作溶液浓度及配制方法配制浓度/(μg/L)母液浓度/(μg/L)吸取体积/mL定容体积/mL溶剂1 000.0100 0001.0100甲醇50.01 0000.510甲醇20.01 0000.210甲醇5.0501.010甲醇1.0500.210甲醇0.5500.110甲醇配制中间液及工作液使用了1个100 mL单线标容量瓶（A级）和5个10 mL单线标容量瓶（A级），查询《常用玻璃量器》（JJG 196—2006）检定规程[23]可知，100 mL单线标容量瓶（A级）在20 ℃下最大允许误差为±0.10 mL，10 mL单线标容量瓶（A级）在20 ℃下最大允许误差为±0.020 mL，按矩形分布K=3，容量瓶的不确定度为：uVs1=0.103=0.057 7 mL；uVs2=0.023=0.011 5 mL。实验室温度在（20±4）℃内波动，甲醇的体积膨胀系数为1.18×10-3/℃[24]，产生的体积变化分别为：±（100×4×1.18×10-3）=±0.118 mL；±（10×4×1.18×10-3）=±0.011 8 mL。温度变化按矩形分布K=3，其不确定度分别为：uVs3=0.1183=0.068 1 mL；uVs4=0.011 83=0.006 81 mL。合成单线标容量瓶误差和温度2种因素引入的不确定度，100 mL单线标容量瓶（A级）和10 mL单线标容量瓶（A级）的相对标准不确定度分布为：urelVs1=u2(VS1)+u2(VS3)V=0.089 3100=0.089 3%；urelVs2=u2(VS2)+u2(VS4)V=0.013 410=0.134%。配制标准中间液及标准工作溶液所用移液器的相对标准不确定度见表4。由表4可知，吸取体积越小，其相对标准不确定度越大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T004表4地西泮标准工作溶液配制过程中移液器的不确定度分析标准溶液浓度/(μg/L)移液器规格/μL吸取体积/μL移液器最大允许误差/%包含因子相对标准不确定度/%0.5100100±2.031.1551200200±1.530.86651 0001 000±1.030.57720200200±1.530.866501 000500±1.030.5771 0001 0001 000±1.030.577合成以上不确定度分量，其中urelVs1计算5次，urelVs2计算1次，在地西泮标准工作溶液配制过程中，溶液体积引入的不确定度为：urelVs=∑urel2(Vsi)=1.98%。（3）标准曲线线性拟合产生的不确定度。采用最小二乘法，横坐标为地西泮浓度，纵坐标为对应峰面积，绘制标准曲线，得到线性回归方程为Y=66 084X+16 530，相关系数R=0.999 9，具体数据见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T005表5地西泮系列标准工作溶液对应的峰面积标准工作溶液浓度Ci/(μg/L)峰面积Ai/(mAU·min)计算得到的峰面积Af/(mAU·min)（Ai-Af）2Ci-C¯20.539 12149 572109 223 401219.041.068 35282 614203 404 644204.495.0365 918346 950359 785 024106.0920.01 350 2811 338 210145 709 04122.0950.03 314 3683 320 73040 475 0441 204.09对待测鱼饵试样进行6次测量，测得峰面积A，由线性回归方程求得试样中地西泮的浓度c为23.821 μg/kg，标准工作溶液平均浓度c¯为15.3 μg/L，标准工作曲线线性拟合引入的相对不确定度为：uq=∑i=1n(Ai-Af)2n-2b×1p+1n+(c-c¯)2∑i=1n(ci-c¯)2=0.163 5 μg/kg。式中：Ai为标准工作溶液对应的峰面积（mAU×min）；Af为通过标准曲线计算得到的标准工作溶液峰面积（mAU×min）；n为标准工作溶液的数量，n=5；b为拟合的标准曲线斜率；p为鱼饵试样的测量次数，p=6；c为鱼饵试样测量的平均值（μg/L）；c¯为标准工作溶液浓度的平均值（μg/L）；ci为标准工作溶液浓度（μg/L）。标准工作曲线线性拟合引入的相对标准不确定度为：urelq=u(q)c=0.163 523.821=0.68%。（4）合成标准溶液的不确定度。将标准曲线拟合产生的不确定度、标准品纯度引入的不确定、标准溶液配制引入的不确定度进行合成，由标准溶液引入的不确定度为：urelc=urel2(cs)+urel2(Vs)+urel2(q)=2.72%。2.3.4试样重复测量产生的不确定度对鱼饵试样进行6次重复测量，通过标准曲线进行计算，结果见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T006表6鱼饵试样6次重复测量结果项目测定值X/(μg/kg)平均值X¯/(μg/kg)标准偏差S123456数值25.05324.02223.28923.24923.94923.36723.8210.692试样重复测量产生的相对不确定度为：urelrep=SX¯=0.69223.821 =2.90%。2.3.5检测仪器引入的不确定度由液相色谱-串联质谱仪校准证书所示，试验所用LC-MS/MS 8050液相色谱-串联质谱仪峰面积重复性为0.4%，按矩形分布K=3，则液相色谱-串联质谱仪引入的相对标准不确定度为：urelI=0.4%3=0.23%。2.3.6合成不确定度评定使用液相色谱-串联质谱法测定鱼饵中地西泮的相对标准不确定的来源和其相对标准不确定度，结果见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.023.T007表7标准不确定的来源和其相对标准不确定度不确定度分量不确定度来源相对标准不确定度/%urelm试样称量2.04urelV复溶0.82urelS标准溶液2.72urelrep试样重复测量2.90urel（I）检测仪器0.23根据表7数据计算相对标准不确定度为：urelX=urel2m+urel2(V)+urel2(c)+urel2(rep)+urel2(I)=4.55%。在置信概率为95%时，取包含因子K=2，该鱼饵中地西泮的相对扩展不确定度为：UrelX=K×urelX=2×4.55%=9.10%。该鱼饵中地西泮的含量为23.821 μg/kg，得扩展不确定度为：U=23.821×9.10%=2.168 μg/kg。综上可得鱼饵中地西泮含量的不确定度报告为（23.821±2.168）μg/kg（K=2）。3讨论不确定度是与测量结果相关联的参数，表征赋予被测量值的分散性[25-26]。本试验发现，相对标准不确定度值超过2%的不确定度来源有试样称量、标准溶液配制和试样重复测量，这与林功师[27]、张惠峰等[28]的评估结果相似。标准溶液配制这一不确定度来源中，配制标准溶液时使用容量瓶和移液器贡献了较大的不确定度，为1.98%，这与较多水产品中兽药残留不确定度评价结果相似[29-30]。复溶引入的不确定度与液相色谱-串联质谱仪引入的不确定度较低，均低于1%，可忽略不计。4结论本研究通过建立数学模型，评定检测过程中各因素的不确定度，结果表明，鱼饵中地西泮含量测定的不确定度主要来自试样重复测量和标准溶液配制，其次为样品称量。因此，在试验过程中可适当增加平行样的测定，以降低其不确定度的影响；标准溶液的配制应规范操作，尽量选用容量允差相对较小的容量瓶，可以使用允差较小的移液管代替移液器，以提高结果的准确性和可靠性；使用精度较高、误差较小的电子天平，减少仪器设备本身带来的误差。