氧化应激指机体因疾病或刺激导致氧自由基过度积累时机体内氧化平衡稳态失调的状态。动物的氧化应激可由多种因素引起，如致病菌和养殖环境[1]。氧化应激能够影响畜禽的健康状况与生产性能，合理调节机体氧化应激状态具有重要意义。目前主要通过在饲料中添加抗氧化剂调节畜禽机体的氧化应激[1]。合成抗氧化剂具有成本低和产量大的优点，但其安全性欠佳[2]。天然植物抗氧化剂具有毒副作用小且环保的优点。研究表明，饲粮中添加厚朴酚可提高仔猪肝脏抗氧化酶水平，增强仔猪血脂代谢能力[3]；牛至精油可降低羔羊血清中丙二醛（MDA）含量，增强抗氧化酶表达，进而改善羔羊的生长性能[4]。以上研究表明，天然植物可在一定程度上取代合成抗氧化剂。白术（Atractylodes macrocephala Koidz.）是菊科苍术属植物，含有多糖、挥发油及内酯类等多种化学成分[5]。研究表明，白术多糖可降低脂多糖（LPS）引起的雏鹅脾脏氧化应激和炎性细胞因子水平[6]。白术挥发油可激活核因子E2相关因子2（Nrf2），提高血红素加氧酶1（HO-1）及醌氧化还原酶1（NQO1）的表达，缓解小鼠急性肝损伤[7]。此外，白术内酯Ⅲ可上调结肠炎小鼠结肠组织中Nrf2的表达，改善小鼠的氧化应激状态[8]。以上研究表明白术具有抗氧化活性，但目前关于白术抗氧化活性成分与相应作用靶点的研究较少。本文通过网络药理学和分子对接技术研究白术调节氧化应激的主要活性物质和作用靶点，揭示白术调节氧化应激的作用机理，为白术在调节畜禽氧化应激方面的应用提供参考。1材料与方法1.1白术活性成分筛选和靶点预测使用TCMSP数据库（https://tcmsp-e.com/）筛选白术的活性成分与其作用的蛋白质靶点，以“白术”为搜索关键词，以口服利用度与类药性为指标筛选活性成分，设置筛选条件为口服利用度≥30%，类药性≥0.18。使用Uniprot数据库（https://www.uniprot.org/）将满足筛选条件的蛋白质靶点名称标准化为基因名称。1.2疾病相关靶点收集使用“oxidative stress”为检索关键词分别在OMIM数据库（https://omim.org/）与GeneCards数据库（https://www.genecards.org/）中检索调节氧化应激的蛋白质靶点，获取到的蛋白质靶点取交集并去除重复项，利用Uniprot数据库将筛选得到的疾病靶点名称转化为基因名。1.3交集靶点筛选及白术-主要活性成分-靶点网络构建使用韦恩图在线生成工具Venny 2.1.0（http://www.liuxiaoyuyuan.cn/）对白术主要活性成分的作用靶点和疾病靶点取交集，绘制韦恩图。通过生信分析软件Cytoscape 3.7.2构建“白术-活性成分-靶点”网络图。1.4蛋白相互作用（PPI）网络的构建及核心靶点筛选使用STRING 11.5平台（https://string-db.org）进行PPI网络构建，将白术和氧化应激的交集靶点上传至“Multiple Proteins”项下，选择物种为“智人”，将PPI结果导出为tsv文件，再将tsv文件导入CytoScape 3.7.2软件，绘制PPI网络图。1.5GO功能和KEGG通路富集分析通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对白术活性成分与疾病的交集靶点进行GO和KEGG富集与注释分析，使用微生信网站（http://www.bioinformatics.com.cn/）将GO和KEGG富集分析结果可视化为条形图与气泡图，从基因功能与代谢通路的角度分析白术主要活性成分调节氧化应激的生物过程与潜在机制。1.6分子对接将PPI网络中的靶点按度值进行排序，将白术主要活性成分与度值排名前五的靶点及其他与调控氧化应激密切关联的靶点进行对接，通过PubChem数据库（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获得白术主要活性成分的3D配体结构文件，使用OpenBabel 3.1.1软件将3D结构文件转换为mol2格式，使用ADT1.5.7工具库对配体文件进行加氢，计算电荷操作，并保存为pdbqt文件格式，以便后续进行对接操作。通过Uniprot数据库检索待对接靶点的“Entry”编号，使用相应的Entry编号在PDB数据库（https://wwwl.rcsb.org/）中准确检索靶点的3D受体结构文件，导出为pdb格式，利用Pymol去除蛋白结构中的水分子及其他无用配体。使用ADT 1.5.7工具库对受体进行加氢，计算电荷操作，将受体文件另存为pdbqt格式。使用AutoDock Vina 1.1.2软件将处理好的靶点和配体进行分子对接，结合能可以反映靶点和配体间的对接性能。2结果与分析2.1白术主要活性成分筛选结果检索得到54种白术活性成分，以口服利用度≥30%和类药性≥0.18两个ADME属性作为筛选条件，共筛出6个主要成分。白术分子编号及名称见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.T001表1白术分子编号及名称活性成分分子编号口服利用度/%类药性12-千里光酰基-8-反式白术三醇MOL00002062.400.2214-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇MOL00002160.310.31α-香树脂醇MOL00002839.510.76β-谷甾醇MOL00003336.230.783β-乙酰氧白术酮MOL00004954.070.228β-乙氧基白术内酯ⅢMOL00007235.950.212.2白术主要活性成分-氧化应激交集靶点筛选及成分-疾病靶点网络构建经查询相关数据库得到140个白术主要活性成分的作用靶点，8 582个与氧化应激相关的疾病靶点，将作用靶点与疾病靶点取交集，使用在线工具制作Venn图，筛选出133个活性成分与氧化应激的交集靶点（见图1）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.F001图1白术-氧化应激交集靶点Venn图白术主要活性成分与其对应的氧化应激相关靶点见表2，使用Cytoscape制作白术-主要活性成分-靶点网络图（见图2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.T002表2白术主要活性成分与对应的氧化应激相关靶点分子编号活性成分关键靶点MOL00002012-千里光酰基-8-反式白术三醇白蛋白、胱天蛋白酶3、丝裂原活化蛋白激酶1、丝裂原活化蛋白激酶14MOL00002114-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸3-激酶催化亚基α、组蛋白-赖氨酸 N-甲基转移酶、磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸3-激酶催化亚基γ、磷脂酰肌醇4，5-二磷酸3-激酶催化亚基β、凝血酶原MOL000028α-香树脂醇白蛋白、雌激素受体1、丝裂原活化蛋白激酶1、丝裂原活化蛋白激酶14、孕激素受体MOL000033β-谷甾醇雄激素受体、细胞色素P450 19A1、细胞色素P450 17A1MOL0000493β-乙酰氧白术酮丝裂原活化蛋白激酶14、一氧化氮合酶3、丝裂原活化蛋白激酶8、胸苷酸合成酶、磷脂酰肌醇4, 5-二磷酸3-激酶催化亚基δMOL0000728β-乙氧基白术内酯Ⅲ白蛋白、表皮生长因子受体、非受体酪氨酸激酶、胱天蛋白酶3、热休克蛋白 HSP90α、雌激素受体、丝裂原活化蛋白激酶1、过氧化物酶体增殖物激活受体γ、丝裂原活化蛋白激酶14、NAD（P）H醌脱氢酶1、NAD（P）H醌脱氢酶210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.F002图2白术-主要活性成分-靶点网络由图2可知，网络中存在147个节点、227条边。2.3白术主要活性成分-氧化应激PPI网络构建将133个交集靶点上传至String 11.0数据库，得到PPI网络文件，通过Cytoscape 3.7.2进行可视化作图，构建蛋白PPI网络（见图3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.F003图3白术与氧化应激交集靶点PPI网络由图3可知，PPI网络中共包含133个节点和1 246条边，其中度值排名前五的靶点分别为白蛋白（ALB）、表皮生长因子受体（EGFR）、天冬氨酸半胱氨酸酶3（CASP3）、原癌基因酪氨酸蛋白激酶（SRC）和前列腺素合酶2（PTGS2）。PPI分析还发现，氧化应激相关靶点有丝裂原活化蛋白激酶1（MAPK1）、NQO1和醌氧化还原酶2（NQO2）等。2.4GO富集与KEGG通路富集分析通过DAVID数据库对交集靶点进行GO富集分析，共得到生物过程294项、细胞组分58项、分子功能108项，通过微生信网站在线工具制作GO功能富集图（见图4）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.F004图4GO富集分析结果由图4可知，交集靶点涉及的生物过程主要有信号转导、DNA模板转录的正调控、RNAPⅡ启动子转录正调控、细胞凋亡过程的负调控及对药物的反应等；细胞组分主要涉及胞质溶胶、细胞质、细胞核及核质等；分子功能主要包括蛋白质结合、ATP结合、锌离子结合及酶结合等。使用DAVID在线数据库对交集靶点进行KEGG富集分析，共富集到127条信号通路，将P值由小到大排序，取排名前30的信号通路使用微生信在线工具制作信号通路富集气泡图（见图5）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.F005图5KEGG富集分析结果由图5可知，富集到与抗氧化相关的通路有TNF信号通路、糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路、IL-17信号通路和PI3K-Akt信号通路等。2.5分子对接结果（见表3）将白术主要活性成分12-千里光酰基-8-反式白术三醇、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇、α-香树脂醇、β-谷甾醇、3β-乙酰氧白术酮和8β-乙氧基白术内酯Ⅲ分别与PPI分析中Degree值排名前5的靶点ALB、EGFR、CASP3、SRC、PTGS2及抗氧化关键靶点NQO1、NQO2、MAPK1进行对接，最终得到48组分子对接结果。其中，受体-配体结合自由能＜-5.00 kcal/mol的结果共有47组，受体-配体结合自由能＜-7.00 kcal/mol的结果共有27组。白术部分高对接活性化合物分子对接模式见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.F006图6白术部分高对接活性化合物分子对接模式由表3、图6可知，白术各主要成分与潜在作用靶点具有较好的对接活性，其中α-香树脂醇与MAPK1、EGFR的结合能最高，为-9.70 kcal/mol；与ALB的结合能次之，为-9.60 kcal/mol。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.019.T003表3分子对接结果靶点名称结合能/(kcal/mol)12-千里光酰基-8-反式白术三醇14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇α-香树脂醇β-谷甾醇3β-乙酰氧白术酮8β-乙氧基白术内酯ⅢALB-6.3-7.1-9.6-8.7-8.0-7.5CASP3-5.7-6.1-7.5-6.3-6.3-6.2EGFR-4.8-5.7-9.7-7.6-7.2-7.2SRC-6.2-6.6-9.4-8.5-7.5-7.2PTGS2-5.8-6.8-9.3-8.1-6.7-6.3MAPK1-5.6-5.7-9.7-8.9-6.9-7.7NQO1-7.5-7.7-8.6-9.0-7.7-7.5NQO2-5.6-5.9-7.6-7.4-6.9-6.7注：受体-配体结合能-4.25 kcal/mol可认为化合物与靶点有结合活性，结合能-5.00 kcal/mol则说明化合物与靶点结合良好，结合能-7.00 kcal/mol可认为化合物与靶点间具有较强的对接能力[9]。3讨论目前，已有研究发现白术具有较好的抗氧化作用[10-11]，但白术抗氧化应激的功效成分与其对应的作用靶点尚未被系统阐明，白术调节氧化应激过程中涉及的具体机制尚未明确。基于此，本研究使用网络药理学与分子对接的方法探究白术的主要活性成分和与之对应的抗氧化应激相关靶点，预测了靶点间的相互作用及主要活性成分与主要靶点间的结合能力，从多个方面探究了白术的抗氧化应激作用机制，对于揭示白术的具体抗氧化应激机制具有一定的意义。3.1白术活性成分分析本研究通过TCMSP数据库筛选出白术的54种化学成分，其中12-千里光酰基-8-反式白术三醇、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇、α-香树脂醇、β-谷甾醇、3β-乙酰氧白术酮及8β-乙氧基白术内酯Ⅲ具有良好的口服利用度与类药性，可能是白术发挥抗氧化作用的主要活性成分。香树脂醇类化合物具有良好的抗氧化能力，α-香树脂醇具有良好的DPPH自由基清除能力[12]。MOHAMMAD等[13]研究发现，天然药用植物塞内加尔裸实的抗氧化标志物β-香树脂醇可有效改善二氯荧光素诱导的HuH7细胞氧化应激状态，但其发挥抗氧化能力的具体机制尚未阐明。β-谷甾醇普遍存在于植物中，具有抗氧化、抗炎等多种生物活性[14]。严宁等[15]研究发现，β-谷甾醇可有效降低心肌缺血再灌注大鼠血清中MDA与活性氧（ROS）的含量，下调细胞外调节蛋白激酶通路缓解氧化应激损伤。此外，β-谷甾醇可降低牛乳腺上皮细胞中核因子κB（NF-κB）与肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的表达，减少细胞内ROS的累积，改善细胞的氧化还原状态[16]。内酯类化合物是白术的重要活性成分，白术内酯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ均具有良好的抗氧化活性[11]。HUAI等[17]发现，白术内酯Ⅲ对博莱霉素诱导的肺部纤维化与氧化应激均具有治疗作用，可提升肺纤维化大鼠血清中的超氧化物歧化酶活性与谷胱甘肽水平，降低乳酸脱氢酶活性和MDA含量。也有研究结果表明，白术内酯Ⅲ可能通过提高Nrf2、NQO1和HO-1的表达来发挥其抗氧化作用[17]。目前，对12-千里光酰基-8-反式白术三醇、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇以及3β-乙酰氧白术酮的研究较少，其药理活性及作用机制尚待探究。3.2白术抗氧化应激相关靶点分析本研究经过PPI分析得到NQO1、NQO2及MAPK1等与抗氧化应激相关的靶点。NQO1是一种广泛存在于哺乳动物体内的双电子还原酶，可将苯醌还原为氢醌并减少内源性苯醌的合成，进而减少ROS的生成[18]。SIEGEL等[19]研究表明，NQO1与NAD（P）H结合可有效清除超氧阴离子，改善细胞的氧化还原状态，同时抑制其自氧化。NQO1受上游靶点Nrf2调控，当Nrf2过表达时，NQO1水平显著升高[20]。此外，NQO1可使内源性抗氧化因子泛醌和α-生育酚醌保持还原状态[20]，维持氧化还原平衡。NQO1可与低氧诱导因子-1（HIF-1α）结合，增强其稳定性，降低蛋白酶对其降解能力，间接增强细胞抗氧化能力[21]。NQO2结构和功能与NQO1高度相似[22]，对NQO1抑制剂具有拮抗作用[23]。MAPK1是一种丝裂原活化蛋白激酶，MAPK蛋白激酶家族可调节Nrf2信号通路[24]。此外，PPI分析还筛选出PDPK1、CASP3和CASP7等与细胞凋亡相关的靶点。氧化应激与细胞凋亡存在密切联系，机体发生氧化应激时产生的大量ROS促进了Caspase蛋白酶家族与细胞色素C的表达，激活了下游半胱天冬酶，促进了细胞凋亡，进而防止细胞在持续的氧化应激状态下无限增殖[25]。PDPK1是一种蛋白激酶，可磷酸化多种蛋白。研究表明，PDPK1可通过磷酸化核因子κB激酶亚基β抑制因子（IKKB）激活NF-κB通路，诱导细胞凋亡[26]。CASP3是细胞凋亡的关键基因，当细胞发生损伤时，线粒体膜结构完整性被破坏，其中的细胞色素C被释放到胞外并激活CASP3，引发细胞凋亡过程[27]。CASP7是一种促凋亡蛋白，可催化蛋白质切割，介导细胞凋亡[28]。SEN等[29]发现，线粒体中α-酮戊二酸脱氢酶过表达可产生ROS导致细胞凋亡，在这一过程中，CASP3被激活，其内源性底物蛋白激酶B（AKT）被活化的CASP3切割，AKT的裂解导致了NF-κB通路的激活，进而引发细胞凋亡。3.3白术的生物功能与通路富集分析本研究中，GO功能富集分析显示，与白术主要成分发挥抗氧化作用相关的关键生物过程包括信号转导、DNA模板转录的正调控、RNAPII启动子转录的正调控及细胞凋亡过程的负调控等生物过程相关；同时，胞质溶胶、细胞质、细胞核及核质等可能为白术发挥抗氧化作用的重要细胞组分。KEGG分析主要富集到4条与抗氧化相关的通路，分别为TNF、AGE-RAGE、IL-17和PI3K-Akt信号通路。TNF是免疫系统的主要调节因子。研究表明，氧化应激可引起中枢神经细胞蛋白降解障碍，导致受损蛋白与细胞器在细胞内堆积，TNF可与TNF受体结合并募集其他凋亡相关蛋白如TNF受体相关因子（TRAF）细胞凋亡蛋白（cIAP）等组成复合体，激活NFκB信号通路，诱导细胞凋亡[30]，从而保证非功能性蛋白的降解。晚期糖基化终末产物（AGE）与其受体结合形成的复合物可诱导ROS的产生，同时激活多种与氧化应激与细胞凋亡相关的信号通路，包括有丝分裂原活化蛋白激酶（P38）、NF-κB和TNF信号通路[31]，从而引起氧化应激。有研究表明，AGE与ROS的调控关系是双向的，使用抗氧化剂可有效降低糖尿病大鼠体内的AGE水平[32]。IL-17通常调节体内炎症、肿瘤的发展过程。据报道，IL-17还可通过增加NADPH氧化酶4（NOX4）依赖的ROS生成，诱导细胞氧化应激[33]。PI3K/Akt通路可磷酸化Nrf2蛋白的丝氨酸位点，减弱其与Kelch样蛋白（Keap1）的结合，激活Nrf2并增强其表达水平，促进其向细胞核的易位[34]，改善机体的氧化还原状态。WEN等[35]研究发现，抑制Nrf2与PI3K/Akt的表达可有效降低6'-O-没食子酰芍药苷对PC12细胞的保护作用，表明PI3K可通过激活Nrf2来实现对机体氧化状态的调节。本研究结果显示，6种主要成分与抗氧化靶点的对接结合能大部分小于-5.00 kcal/mol，表明6种成分与靶点间亲和力较强，具有良好的对接活性，可作为白术抗氧化相关研究的依据。4结论本研究结果表明，白术调节氧化应激的分子机制可能是基于12-千里光酰基-8-反式白术三醇、14-乙酰基-12-千里光酰基-8-反式白术三醇、α-香树脂醇、β-谷甾醇、3β-乙酰氧白术酮和8β-乙氧基白术内酯Ⅲ等活性成分调控ALB、CASP3、EGFR、SRC、PTGS2、MAPK1、NQO1和NQO2等靶点，经TNF、AGE-RAGE、IL-17和PI3K-Akt等信号通路发挥作用。