仔猪断奶后处于内部器官发育和外部环境变化的过渡阶段，在断奶1~2周内极易出现腹泻、生长缓慢、食欲不振等现象[1]。研究发现，在断奶仔猪饲粮中添加2 000~4 000 mg/kg氧化锌能够有效预防断奶仔猪腹泻，改善仔猪生长性能[2-3]。长期高剂量的氧化锌添加会造成猪被毛长乱、免疫机能下降、消化吸收功能减弱，而且氧化锌利用率较低，大部分锌经粪便排入环境，造成环境污染[4]。养殖过程应严控饲料中锌的用量。包被纳米氧化锌是采用适宜的包衣材料对纳米氧化锌进行包被的新型氧化锌产品。包被工艺处理能够减少氧化锌在胃部的损失，提高其生物利用率[5]。本试验拟探究新型包被纳米氧化锌的胃肠溶出特性及其对断奶仔猪生长性能、腹泻率、免疫功能和肠道屏障功能的影响，为合理降低氧化锌的用量提供参考。1材料与方法1.1试验材料包被纳米氧化锌（氧化锌≥90%）由浙江万方生物科技有限公司提供，采用高分子材料对纳米氧化锌进行包被处理；纳米氧化锌原料（氧化锌≥99%）购自市场。1.2包被纳米氧化锌的人工胃肠液溶出试验1.2.1人工胃肠液的配制根据HUANG等[6]的研究配制人工胃液和人工肠液。1.2.2胃部留存率测定采用溶出度仪测定纳米氧化锌在人工胃液中2 h的崩解情况，溶出度仪设定温度39 ℃，200 r/min，溶出杯中加入500 mL人工胃液，分别加入2.0 g纳米氧化锌和包被纳米氧化锌（以氧化锌计）。胃部崩解率=1-(滤上物重量×锌含量)×100%/(2.0×初始锌含量)(1)1.2.3胃肠崩解率测定取2.0 g纳米氧化锌和包被纳米氧化锌，按照1.2.2进行胃液崩解，2 h后转入人工肠液中，崩解过程中维持pH值不变。4 h后过滤，干燥，测定其中的总锌含量。胃肠总崩解率=(滤上物重量×锌含量)×100%/(2.0×初始锌含量)(2)总有效率=胃肠总崩解率×(1-胃部崩解率)×100%(3)1.3饲养试验选择192头健康状况良好、体重（7.47±0.62）kg的24日龄左右断奶仔猪（杜×长×大），公、母各半，随机分为4组，每组6个重复，每个重复8头猪。对照组饲喂基础饲粮，试验Ⅰ组、试验Ⅱ组、试验Ⅲ组分别在基础饲粮中添加2 000 mg/kg纳米氧化锌、500 mg/kg包被纳米氧化锌、1 000 mg/kg包被纳米氧化锌。试验期14 d。期间断奶仔猪自由采食、饮水，且消毒和免疫程序严格按照猪场日常管理程序进行。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T001表1基础饲粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米58.00消化能/(MJ/kg)14.01豆粕（43%）17.00粗蛋白/%22.84膨化全脂大豆7.00钙/%0.86鱼粉4.50总磷/%0.75乳清粉4.50赖氨酸/%1.13次粉5.00磷酸氢钙1.50食盐0.25石粉1.10L-赖氨酸盐酸盐（98%）0.15预混料1.00注：1.预混料为每千克饲粮提供：VA1 500 IU、VD3 200 IU、VE 10 IU、VK 5 mg、VB2 3.6 mg、VB1 1.0 mg、VB6 1.5 mg、生物素0.05 mg、叶酸0.3 mg、D-泛酸10 mg、烟酸10 mg、胆碱500 mg、铜6 mg、铁100 mg、锌100 mg、锰50 mg、硒0.30 mg、碘0.14 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能与腹泻率试验开始和结束时，断奶仔猪按重复称重，计算平均日增重（ADG）；试验结束后称量剩余饲料，计算平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。每日观察并记录腹泻仔猪头数。平均日增重=(末重-初重)/试验天数(4)平均日采食量=总消耗饲料量/(试验天数×仔猪头数)(5)料重比=平均日采食量/平均日增重(6)1.4.2血清、肠道黏膜及肠道内容物收集饲养试验结束后，每个重复选取1头仔猪进行前腔静脉采血，4 000 r/min离心15 min，制备血清。放血屠宰，收集盲肠内容物，置于液氮中保存；采用无菌载玻片刮取十二指肠、空肠和回肠黏膜于冻存管中，置于液氮中保存。1.4.3血清免疫指标、肠道通透性指标血清中免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-1β（IL-1β）、白细胞-介素10（IL-10）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、干扰素-γ（IFN-γ）、内毒素（ET）含量和二胺氧化酶（DAO）活性按照ELISA试剂盒说明书采用酶标仪（FC型，赛默飞世尔仪器有限公司）进行测定。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。1.4.4肠道分泌型免疫球蛋白（sIgA）肠道sIgA采用ELISA定量试剂盒进行测定，试剂盒购自Bethyl公司（美国），根据试剂盒说明书，采用酶标仪（FC型，赛默飞世尔仪器有限公司）测定。1.4.5盲肠内容物沙门氏菌、大肠杆菌和乳酸杆菌数量称取盲肠鲜粪，参照文献[7]的方法，使用SS培养基、EMB培养基和MRS培养基分别进行沙门氏菌、大肠杆菌和乳酸杆菌的计数。1.5数据统计与分析试验数据采用Levene检验正态分布和方差齐性，SPSS 20.0进行单因素方差分析，Tukey's法进行多重比较。结果以“平均值±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同形式纳米氧化锌的人工胃肠液溶出率测定结果（见表2）由表2可知，纳米氧化锌在胃液中的留存率仅为7.48%，而包被纳米氧化锌在胃液中的留存率达到90.14%。在肠液中两种纳米氧化锌均可有效崩解，纳米氧化锌的总有效率仅有7.12%，包被纳米氧化锌达到78.54%，说明包被处理可以保护纳米氧化锌免受胃液消化，有效提高纳米氧化锌在肠道中的利用率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T002表2不同形式纳米氧化锌的人工胃肠液溶出率测定结果组别原始含锌量胃部崩解率胃肠总崩解率总有效率纳米氧化锌99.1192.5295.177.12包被纳米氧化锌90.169.8687.1378.54%2.2包被纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响（见表3）由表3可知，不同形式纳米氧化锌添加均显著提高了断奶仔猪末重和ADG（P0.05），显著降低了料重比（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T003表3包被纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响项目初重/(kg/头)末重/(kg/头)ADG/[g/(头·d)]ADFI/[g/(头·d)]料重比腹泻率/%P值0.720.040.040.810.030.02对照组7.58±0.5310.34±1.09b195.0±35.4b388.0±33.12.00±0.18a19.30±1.23a试验Ⅰ组7.52±0.8310.92±0.98a237.0±25.8a411.3±38.61.73±0.24b5.10±0.68bc试验Ⅱ组7.40±0.5310.60±1.05a223.1±36.0a388.2±29.11.74±0.22b6.50±0.71b试验Ⅲ组7.38±0.7110.84±0.99a240.2±23.3a395.4±30.41.65±0.15b4.70±0.55c注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.3包被纳米氧化锌对断奶仔猪血清免疫球蛋白及细胞因子含量的影响（见表4）由表4可知，添加不同形式纳米氧化锌均显著提高了断奶仔猪血清IgM、IgA和IL-10含量（P0.05）。试验Ⅲ组断奶仔猪血清IL-1β水平显著高于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T004表4包被纳米氧化锌对断奶仔猪血清中免疫球蛋白和细胞因子含量的影响项目IgA/(g/L)IgG/(g/L)IgM/(g/L)IL-1β/(ng/L)TNF-α/(ng/L)IFN-γ/(ng/L)IL-10/(ng/L)P值0.030.490.010.040.790.250.04对照组0.41±0.05b1.68±0.110.22±0.02b317.3±25.12b231.2±31.2324.12±2.51216.1±24.16b试验Ⅰ组0.55±0.04a1.77±0.240.34±0.05a355.3±33.51b244.4±28.5220.22±2.55272.5±18.51a试验Ⅱ组0.56±0.07a1.85±0.170.35±0.02a347.7±28.72b219.3±19.3222.18±1.84266.6±25.62a试验Ⅲ组0.64±0.05a1.79±0.190.40±0.03a373.2±22.23a226.7±38.6123.55±2.36277.5±35.11a2.4包被纳米氧化锌对断奶仔猪肠道sIgA含量的影响（见表5）由表5可知，与对照组相比，试验Ⅰ组和试验Ⅲ组断奶仔猪空肠和回肠sIgA含量显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T005表5包被纳米氧化锌对断奶仔猪肠道sIgA含量的影响项目十二指肠空肠回肠P值0.570.030.01对照组38.3±6.8834.5±7.12b37.5±4.11b试验Ⅰ组43.8±5.2247.9±6.09a56.3±5.83a试验Ⅱ组40.5±5.9046.2±3.77ab47.1±3.70ab试验Ⅲ组44.2±4.6954.3±8.38a58.8±7.34aμg/mg prot2.5包被纳米氧化锌对断奶仔猪肠道屏障功能的影响（见表6）由表6可知，与对照组相比，各试验组断奶仔猪血清中DAO活性和ET含量均显著降低（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T006表6不同形式氧化锌对断奶仔猪肠道屏障功能的影响项目DAO/(U/mL)ET/(EU/mL)P值0.040.01对照组9.32±0.44a3.73±0.31a试验Ⅰ组6.52±0.34b2.22±0.31b试验Ⅱ组6.33±0.25b2.43±0.41b试验Ⅲ组6.56±0.32b2.34±0.51b2.6包被纳米氧化锌对断奶仔猪盲肠内容物菌群数量的影响（见表7）由表7可知，各组断奶仔猪盲肠内容物中沙门氏菌、大肠杆菌和乳酸菌数量均无显著差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.02.004.T007表7包被纳米氧化锌对断奶仔猪盲肠内容物菌群数量的影响项目沙门氏菌大肠杆菌乳酸菌P值0.730.060.11对照组5.50±0.596.50±0.427.30±0.36试验Ⅰ组5.30±0.276.20±0.096.90±0.53试验Ⅱ组5.60±0.775.70±0.776.10±0.70试验Ⅲ组5.02±0.375.00±0.656.60±0.47×108 CFU/g3讨论3.1不同形式纳米氧化锌的体外溶出情况分析动物胃肠道中，氧化锌通过其分子态氧化锌在肠道中发挥抗腹泻效果，但是其在低pH值环境中会被分解为锌离子，体内过量的锌随粪尿排出体外，引起环境锌污染[8]。体外人工胃肠液模拟试验是评估制剂产品在动物消化道内崩解、溶出情况的有效手段[9]。包被工艺可以提高氧化锌的胃部留存率，提高肠道有效利用率[10]。这可能是由于氧化锌在胃中与食糜中蛋白、脂肪等形成胶束，加速氧化锌颗粒崩解[11]。本试验发现，包被纳米氧化锌的胃肠道总利用率高于纳米氧化锌，表明纳米氧化锌包被处理可以提高锌在动物体内的利用率，降低环境锌污染。3.2包被纳米氧化锌对断奶仔猪生长性能和腹泻率的影响本试验中，添加不同形式纳米氧化锌均可以显著提高仔猪平均日增重，降低料重比和腹泻率。WANG等[12]研究发现，与无锌组相比，1 200 mg/kg纳米氧化锌可以提高断奶仔猪生长性能，原因可能是纳米氧化锌可以提高仔猪血清中生长激素（GH）的水平。本研究同样发现，500、1 000 mg/kg的包被纳米氧化锌与2 000 mg/kg纳米氧化锌的饲喂效果相当，包被纳米氧化锌具有替代高剂量纳米氧化锌的潜力。LI等[13]研究发现，包被氧化锌可以显著提高断奶仔猪的平均日增重，显著降低料重比，且与氧化锌组结果差异不显著。与高剂量的氧化锌（2 250 mg/kg）相比，低剂量的包被纳米氧化锌（100 mg/kg）对生长猪的促生长效果较弱[14]。本试验表明，与对照组相比，不同形式纳米氧化锌均可以降低仔猪腹泻率，添加1 000 mg/kg的包被纳米氧化锌具有替代高剂量氧化锌原料的潜力。SHEN等[15]研究表明，570 mg/kg包被氧化锌组仔猪的腹泻指数低于2 250 mg/kg氧化锌组。研究表明，与空白组相比，生长猪饲粮中添加低剂量的包被纳米氧化锌（100 mg/kg）可以显著降低腹泻率，与高剂量的氧化锌（2 250 mg/kg）相比，生长猪的腹泻率差异不显著[14]。这可能是由于氧化锌主要靠氧化锌分子在肠道中发挥作用，经过包被处理的氧化锌能够减少在胃液中的损失，从而提高肠道利用效率[16]。3.3包被纳米氧化锌对断奶仔猪血清免疫功能的影响仔猪断奶后，面对环境、饮食和生理应激等因素时，仔猪会产生机体炎症反应等，甚至死亡[17]。IgA、IgG和IgM是动物机体重要的免疫功能蛋白。本研究结果表明，纳米氧化锌可以显著提高血清中IgA和IgM含量，且不同形式纳米氧化锌之间无明显差异，与LONG等[18]的研究结果一致。但也有研究表明，氧化锌对血清中免疫球蛋白含量无影响[19]。王超[20]研究发现，添加不同剂量的包被氧化锌具有提升仔猪血清IgA、IgG和IgM含量的趋势。因此，氧化锌对仔猪血清免疫球蛋白含量的影响存在争议，其原因可能是锌作为免疫系统重要的调节因子，调控机制复杂。此外，试验中动物的应激状态不同，试验过程中动物所处的免疫状态不同，也会导致出现不同的结果。除免疫球蛋白以外，免疫细胞分泌的IFN-γ、IL-1β、IL-10和TNF-α等，在免疫应答及炎症反应中也发挥重要作用。IL-1β作为促炎因子，是炎症反应的重要介质之一。IL-10抑制炎症因子的合成与释放，起到抗炎的作用[21]。本研究结果表明，不同形式纳米氧化锌均可以显著提高血清中IL-10的含量，1 000 mg/kg包被纳米氧化锌提高血清中IL-1β含量的效果最好。MOHAMMAD等[22]在小鼠试验中证实，纳米锌可以提高IL-10含量，降低IL-1β含量。巨噬细胞中锌的缺乏会导致细胞活力下降和IL-10的产生减少[23]。3.4包被纳米氧化锌对断奶仔猪肠道sIgA含量的影响肠道黏膜免疫是机体免疫系统中重要的组成部分，sIgA是黏膜免疫的重要组成成分。申俊华[24]研究表明，仔猪饲粮中添加380、570 mg/kg包被氧化锌可以提高空肠黏膜中sIgA的含量。ZHOU等[25]研究发现，纳米氧化锌可以调节宫内发育迟缓的仔猪（IUGR）空肠中免疫相关基因的表达，提高肠道免疫功能。本研究结果表明，低剂量的包被氧化锌对断奶仔猪肠道sIgA含量的影响和纳米氧化锌原料差异不显著，原因可能是两种纳米氧化锌在肠道中均发生崩解释放足够的锌。3.5包被纳米氧化锌对断奶仔猪肠道屏障功能的影响在动物生长过程中，肠道屏障功能的完整性有利于动物肠道和机体健康，动物肠道发生炎症时，肠道通透性会发生改变[26]。DAO是存在于小肠绒毛中的标记酶，是反映肠道机械屏障完整性和受损程度的重要指标[27]。ET是革兰氏阴性细菌外膜的一种成分，又叫脂多糖（LPS）。血浆ET含量通常较低，但在感染、肠道炎症疾病期间会升高[28]。本试验表明，不同形式纳米氧化锌均能降低仔猪血清中DAO活性和ET含量，与前人在仔猪和肉仔鸡中的研究结果相似[29-30]。这说明本研究中的两种纳米氧化锌的添加剂量均可以改善肠道屏障功能。其原因可能是：纳米氧化锌在肠道内释放锌离子，锌离子促进肠道上皮细胞的增殖与分化，维持肠道屏障功能的稳定[31]；纳米氧化锌通过抑制病原菌的增殖，保护肠道屏障功能[32]。3.6包被纳米氧化锌对断奶仔猪盲肠菌群的影响在动物应激状态下，肠道微生物菌群的紊乱会引起肠道炎症等[33]。本研究中，各组断奶仔猪盲肠中大肠杆菌、沙门氏菌以及乳酸菌的菌群数量无显著差异，但添加不同剂量和剂型的氧化锌有降低大肠杆菌和乳酸菌数量的趋势。王之盛等[34]发现，饲粮中添加2 500 mg/kg纳米氧化锌能够降低仔猪粪便中大肠杆菌和乳酸杆菌的数量。申俊华[24]研究发现，在仔猪饲粮中添加剂不同剂量和剂型的氧化锌降低了仔猪空肠内容物和粪便中的微生物区系丰度和香农指数，这表明氧化锌对于肠道微生物区系的作用与抗生素相似。本试验中，纳米氧化锌对肠道微生物数量虽未表现出显著效果，但有降低趋势，且低剂量包被纳米氧化锌对盲肠微生物数量的影响与高剂量纳米氧化锌原料相似。4结论饲粮中添加500、1 000 mg/kg的包被纳米氧化锌能够促进断奶仔猪生长，降低仔猪腹泻率，增强免疫机能和肠道屏障功能。其中，1 000 mg/kg包被纳米氧化锌组效果较好。