细菌内毒素是革兰氏阴性菌细胞壁外膜上的脂多糖（LPS），为革兰氏阴性菌的主要抗原性及致病性成分，而其生物活性和致病毒力则主要源于化学结构中的类脂A[1-2]。细菌内毒素可导致机体持续发热，影响细胞代谢，引发血管内凝血[3]，并导致革兰氏阴性菌感染者发生败血症和脓毒血症[4]。内毒素可损伤禽类的组织器官并出现坏死性炎症，剂量较大时对牛、马、犬和猪等动物也具有明显的致病力和致死性[5]，直接注射5 EU/kg的内毒素可使家兔体温升高[6]，对小鼠的半数致死量仅为16.54 mg/kg[7]。细菌内毒素在革兰氏阴性菌的生长和消亡中会不断从其外膜上脱落并释放[8]。细菌内毒素普遍存在于水源、食品和各种环境中，尤其是存在于感染者体内，对人类和畜禽等的健康具有潜在危害。猫粮是宠物猫最重要的食物来源。目前我国猫粮市场发展迅速，但质量良莠不齐[9-10]。猫粮原料中肉类占比较大，而肉类保存和处理不当很可能导致细菌内毒素剧增。猫粮相关的标准GB/T 31217—2014并未对细菌内毒素做出限值规定[11]，因此加强对猫粮中细菌内毒素含量的认识有利于规范猫粮市场和保障宠物猫的健康。目前尚无猫粮中细菌内毒素含量测定方法的相关报道。现有的检测方法主要应用于药物等，如家兔热原法[6]、鲎试剂法[12-13]、免疫学法[14]、重组C因子法[15]以及色谱质谱法[16-17]等。其中，鲎试剂法精准可靠，应用最广[18]。本试验在相关研究基础上，参考《中华人民共和国药典》[19]2020年版通则1143中的动态浊度法，拟建立猫粮中细菌内毒素的定量测定方法，为宠物食品和饲料中细菌内毒素的检测提供参考。1材料与方法1.1试剂与材料细菌内毒素检查用水（BET水，内毒素含量0.005 EU/mL，批号22100105，规格5 mL/瓶）、细菌内毒素工作标准品（批号221001，规格10 EU/支）、动态浊度鲎试剂（灵敏度0.03-10 EU/mL，批号22090312，规格0.5 mL/支）、G因子抑制剂（批号221201，规格2 mL/支）均购自福州新北生化工业有限公司。微量加样器及配套的一次性无热原吸头（德国艾本德公司）、无热原15 mL离心管及无菌无热原0.22 μm针头式过滤器（广州洁特生物有限公司）、无菌无热原0.22 μm针头式过滤器（德国拜发公司）、0.22 μm针头式过滤器（天津市津腾实验设备有限公司）。耐高温器皿：研钵、稀释管及细菌内毒素专用检测管（天津市天大天发科技有限公司），以上器皿均经电烤箱250 ℃处理30 min以上，去除可能存在的外源性内毒素。猫粮样品购自本地超市。1.2仪器设备BET-72型细菌内毒素测定仪（天津市天大天发科技有限公司）、BSA224S电子分析天平（精度为0.000 1 g，赛多利斯科学仪器公司）、CR21GIII型高速冷冻离心机（日本日立公司）、EP2PT型电烤箱（广东德玛仕智能厨房设备有限公司）、ZH-3A自动旋涡混合器（天津市天大天发科技有限公司）。1.3试验方法1.3.1标准溶液配制取细菌内毒素标准品1支，加入1.0 mL BET水，充分旋涡混匀15 min溶解，得到10 EU/mL的细菌内毒素标准溶液，使用BET水逐级稀释，旋涡混匀30 s，配制成终浓度为5.0、1.0、0.2、0.04 EU/mL的系列标准曲线溶液。1.3.2样品前处理取适量猫粮样品，分多次于研钵中，充分研磨成粉末状，合并后混合均匀。称取约1 g上述样品，置于15 mL离心管中，加入10 mL BET水，涡旋提取5 min，10 000 r/min冷冻离心5 min。取上清液使用0.22 μm针头式过滤器过滤，再取滤液使用BET水依次稀释，得到稀释因子（定容体积×稀释倍数）为1 000倍以上且细菌内毒素终浓度在合适范围内的供试品溶液。根据样品的细菌内毒素本底含量，在稀释的最后一步另外添加合适浓度的细菌内毒素（一般选择标准曲线中点浓度），作为供试品干扰试验溶液。1.3.3样品测定细菌内毒素测定仪的工作参数设置为：测定波长450 nm，测定温度37 ℃。根据总用量取一定量的鲎试剂，每支加入0.5 mL G因子抑制剂，涡旋30 s，将溶解的鲎试剂混合在一起并轻轻混匀，分别分装0.1 mL到每个专用检测管中（不能产生气泡），即配即用。再将上述标准工作曲线溶液、稀释好的供试品溶液、供试品干扰试验溶液分别取0.2 mL，加入检测管中（加完之后不能产生气泡），封口，涡旋混合30 s，每个上机的样液均平行制备3管，另取BET水做阴性对照。将加完样的检测管放入仪器的设定位置进行检测，检测时间约1 h，待标准曲线最后一个浓度的OD值超过预设值后即可手动停止检测。测定结束后，由仪器自动进行数据处理，分析上机样液的细菌内毒素含量及平行测定管的变异系数，并生成猫粮样品中细菌内毒素含量的检测报告。2结果与分析2.1标准曲线的建立和可靠性试验将1.3.1的系列标准曲线溶液上机测试结果进行分析，以细菌内毒素浓度的对数值（lgc）为横坐标，以平均反应时间对数值（lgT）为纵坐标绘制标准曲线，得到线性回归方程lgT=2.842 92-0.208 00 lgc，相关系数r=-0.995 3，其绝对值|r|＞0.980。阴性对照溶液反应时间（T＞4 120 s）大于标准曲线最低浓度点的反应时间（T=1 413 s），阴性对照有效，平行管之间变异系数均小于5%，表明在0.040~5.00 EU/mL的范围内，细菌内毒素浓度对数值与平均反应时间对数值呈现良好的线性关系，标准曲线成立，试验有效可靠。细菌内毒素标准曲线测定数据及线性关系见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.023.T001表1细菌内毒素标准曲线测定数据及线性关系细菌内毒素浓度/(EU/mL)平均反应时间/s变异系数/%线性回归方程r5.0005164.39lgT=2.842 92-0.208 00lgc-0.995 31.0006752.830.2009352.270.0401 4133.752.2前处理条件的优化细菌内毒素的测定受样品基质的影响较大，但由于操作过程中所使用的器皿均需为无热原或经250 ℃高温，导致可供选择的去除干扰的方法比较有限。一般排除或降低基质干扰的方法有以下几种：调节供试液pH值（应为6.0~8.0）[20]、微温保持加热（75 ℃水浴10 min）[21]、超滤（利用超滤系统将杂质滤除）[22]、样品稀释法[23]（大多数样品通过稀释均可有效地减少基质的影响）和离心法。陈丹丹[24]研究表明，供试液使用滤膜过滤可能会减少其细菌内毒素含量，而使用离心的方法则无影响。肖婧薇等[25]的研究也显示，离心处理不会影响细菌内毒素的检出。与基质单一的药物成分相比，猫粮样品含大量的淀粉、脂肪、蛋白质以及其他成分，其基质成分更为复杂，对测定的干扰更明显。此外，部分猫粮还会添加酵母葡聚糖成分[26]，其中的1, 3-β-D-葡聚糖能激活鲎试剂的G因子，使细菌内毒素测定出现严重的假阳性结果[27-28]。因此，为降低猫粮样品中复杂基质带来的干扰，本试验针对猫粮样品中的1, 3-β-D-葡聚糖，采用配套的G因子抑制剂溶解配制鲎试剂以消除其影响。样品前处理中除了采用高速冷冻离心的方式去除部分脂肪、沉淀较大颗粒杂质之外，也考虑采用滤膜过滤的方式进一步除杂。为考察使用滤膜过滤供试液对其细菌内毒素含量的影响，本试验利用一系列终浓度为5.00、1.00、0.50、0.10 EU/mL的细菌内毒素阳性对照溶液，采用3种品牌的0.22 μm针头式过滤器，将阳性对照原液和过滤后的溶液分别按1.3.3的方法进行上机测定，并计算过滤后的回收率，结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.023.T002表2针头式过滤器过滤前后的测定结果阳性对照溶液标称浓度/(EU/mL)原液测定结果/(EU/mL)品牌A（PTFE材质）品牌B（PES材质）品牌C（PTFE材质）测定结果/(EU/mL)回收率/%测定结果/(EU/mL)回收率/%测定结果/(EU/mL)回收率/%5.004.5104.32095.84.610102.23.56078.91.001.1000.95386.60.95386.70.75068.20.500.6520.51078.20.670102.80.45269.30.100.1050.10297.10.09086.00.06158.1由表2可知，品牌A使用针头式过滤器过滤的回收率为78.2%~97.1%，品牌B为86.0%~102.8%，品牌C为58.1%~78.9%。除了品牌C对细菌内毒素有较大程度的吸附之外，其余两种品牌对细菌内毒素的吸附均较小，说明采用合适的滤膜过滤供试液对测定结果的影响较小。综合评价效果和成本因素，本试验采用品牌B的PES材质针头式过滤器进行样品溶液的过滤除杂。2.3方法的精密度选择4个不同配方的猫粮样品，每个样品平行制备6份，按1.3.2的方法进行前处理，按1.3.3的方法上机测定，并计算6次重复测定的相对标准偏差（RSD），结果见表3。由表3可知，猫粮样品中重复测定的RSD为8.9%~14.0%（n=6），说明该方法的精密度符合一般检测的要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.023.T003表3重复测定的相对标准偏差（n=6）猫粮样品细菌内毒素含量/(EU/mg)RSD/%干粮（鸡肉配方）2.121.832.462.321.902.0511.4干粮（兔肉配方）3.814.064.443.684.313.568.9干粮（鱼肉配方）1.271.231.310.961.431.1912.9冻干肉粒0.510.430.450.530.350.4614.02.4干扰试验及回收率、方法的定量限在前处理时，将上述4个猫粮样品制备成不同稀释倍数的供试品溶液，同时制备与对应的供试品溶液有相同稀释倍数且添加外源细菌内毒素浓度为1.0 EU/mL的供试品干扰试验溶液，上机测定并计算干扰试验的回收率，结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.023.T004表4供试品干扰试验及回收率猫粮样品稀释因子f供试品溶液细菌内毒素浓度/(EU/mL)添加细菌内毒素浓度/(EU/mL)干扰试验细菌内毒素浓度/(EU/mL)回收率/%干粮（鸡肉配方）1 0003.011.04.91190.03 0000.812.53171.810 0000.211.45123.8干粮（兔肉配方）1 0006.231.08.20197.03 0001.502.91141.010 0000.381.52113.9干粮（鱼肉配方）5004.551.06.91236.01 0002.053.99194.03 0000.622.40178.410 0000.131.53140.3冻干肉粒5001.431.03.69226.01 0000.632.40176.83 0000.211.94173.510 0000.051.32126.9由表4可知，当样品稀释倍数较低时（稀释因子f=500），回收率均超过200%，所测得的细菌内毒素含量也较高；加大稀释倍数之后（稀释因子f≥1 000），回收率则均在50%~200%之间，符合细菌内毒素的检测要求。结果表明，对于猫粮样品，在允许范围内尽可能增加样品溶液的稀释倍数可以更好地减少基质干扰，同时制备干扰试验方可提高试验的准确度。在本试验中，标准曲线的最低浓度点为0.04 EU/mL，取样量为1 g，综合上述分析取稀释因子f=1 000，计算得到猫粮样品中细菌内毒素的定量限为0.04 EU/mg。2.5实际样品的测试采用本试验的方法对另外12批市售的猫粮（含猫罐头）进行细菌内毒素的测定，检测结果见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.023.T005表5猫粮样品的测定结果编号猫粮类型细菌内毒素含量/(EU/mg)干扰试验回收率/%1干粮1.00102.92干粮0.93105.63干粮0.04119.84干粮1.1098.05干粮4.70146.06干粮15.00122.57冻干2.90136.08冻干1.10120.69冻干1.20145.210罐头0.04150.311罐头0.0493.612罐头0.04118.7由表5可知，除猫罐头外，猫粮干粮和冻干样品中仅有1批样品未检出细菌内毒素（0.04 EU/mg），其余的8批样品含量在0.93~15 EU/mg之间，检出率为89%，说明目前市面所售的猫粮干粮和冻干中普遍含有细菌内毒素。同时，3批猫罐头样品均未检出细菌内毒素（0.04 EU/mg），推测可能与猫罐头的生产工艺有关。因为所有的罐头产品在生产过程中都要经过121 ℃高温高压蒸汽灭菌[29]，使罐头中绝大部分的细菌内毒素被消除[30]。3讨论鲎试剂法测定细菌内毒素的原理是内毒素会激活鲎试剂中的鲎血细胞溶解物，继而发生一系列凝集酶反应，最终形成可观测的凝胶状物质[18]。而动态浊度法则是根据内毒素与鲎试剂产生凝胶反应时反应溶液的浊度到达某一吸光度的时间来定量测定内毒素的含量[19]。由于鲎试剂法涉及一系列酶促反应，易受到样品基质的干扰而影响结果的准确性，因此，鲎试剂法通常用于基质单一的药物成分的细菌内毒素的检查，试验过程中也必须同时制备加标干扰试验，当回收率在50%~200%时才能够保证一定的准确性。猫粮需要满足宠物猫的全部营养需求，包含了大部分的营养物质，样品基质通常较为复杂，导致猫粮中细菌内毒素的测定会受到较多因素的干扰，降低或消除这些干扰因素才能够保证测定结果的准确性。然而，细菌内毒素在环境中几乎无处不在，为了不引入外源的内毒素，在测定过程中所涉及的所有耗材和器皿必须为无热原，因此消除基质干扰的方法选择余地不多。面对有限的条件，本试验查阅了相关的文献并做了考察试验，结果表明对供试液进行离心和过滤并不影响细菌内毒素的测定，可将其作为去除基质干扰的初步手段，同时采用增加供试液稀释倍数的方法进一步降低干扰。此外，猫粮样品中还可能含有葡聚糖，葡聚糖会激活鲎试剂的G因子旁路反应，使测定结果偏大或产生假阳性结果。针对此现象，本试验选择了与鲎试剂配套的G因子抑制剂，抑制或阻断G因子旁路反应，进而消除葡聚糖类物质的干扰。这些前处理方法操作简便快速，效率较高，耗材和试剂成本较低，具备一定的优势。本试验的方法学验证结果也表明：标准曲线的线性良好（相关系数r=-0.995 3，|r|＞0.980），可用于定量检测；当稀释因子≥1 000时，加标干扰试验的回收率均在50%~200%之间，准确性较高；重复测定的RSD为8.9%~14.0%，重现性较好；方法的定量限为0.04 EU/mg，满足猫粮样品的检测需求。综上所述，本方法的前处理过程操作方便、简单快捷、成本较低、结果准确、灵敏度较高，因此具有较强的可行性，适用于猫粮样品中细菌内毒素的定量测定。4结论本试验建立了采用鲎试剂动态浊度法对猫粮中细菌内毒素进行定量测定的分析方法。猫粮样品中的细菌内毒素经BET水提取之后，对提取液进行冷冻高速离心和针头式过滤器过滤，再对滤液进行适当稀释（稀释因子f≥1 000），结合采用G因子抑制剂配制鲎试剂，以达到减少样品中大部分杂质干扰的目的；最后使用细菌内毒素自动测定仪（动态浊度法）测定样品中的细菌内毒素含量。结果表明，该方法适用于实际样品的测定，为检测猫粮样品中的细菌内毒素含量提供了可靠的手段，对规范猫粮市场具有一定的现实意义，同时也为其他类型样品中细菌内毒素的测定提供了参考。