水产微生态制剂是由水产动物体内或环境中的益生菌经分离、筛选和鉴定，再经选育、发酵和制剂等工艺制备而成[1]。水产微生态制剂不仅有利于促进动物肠道健康[2]，还有助于降解植物蛋白等大分子和抗营养因子[3]，提高饲料蛋白利用率。水产微生态制剂还可缓解因蛋白质消化吸收不完全引起的氮排泄而造成的水环境污染[4]。近年来，许多学者从欧洲鳗鲡、章鱼、凡纳滨对虾肠道中分离筛选出了高产蛋白酶菌株MJ15、QDV-3和LVi-6[5-7]。张建荣等[8]从冷水鱼肠道中分离出1株低温产蛋白酶菌株P-D-10。HARIHARAN等[9]从土壤中分离到5株产蛋白酶菌株S1~S5。虽然目前国内外学者在饲用产蛋白酶益生菌及微生态制剂的开发方面取得了一些进展，但远远不能满足生产需求。黄鳝（Monopterus albus）是我国重要的名优经济鱼类之一，兼具食用、药用和经济价值[10]，是肉食性鱼类。黄鳝饲料的最适蛋白水平为37%~40%[11]。高蛋白饲料可增加黄鳝的机体蛋白水平，减少体脂肪含量，从而使黄鳝肉质更鲜美[12]。人工养殖黄鳝驯食烦琐[13]，黄鳝消化能力较弱，因此可向其饲料中添加产蛋白酶的益生菌以促进肠道健康。从提高水产养殖饲用产蛋白酶益生菌的生物效价角度考虑，应从动物体内或其养殖环境中分离和筛选益生菌[14]。然而，目前未见黄鳝源产蛋白酶菌株的相关研究。因此，本研究拟从人工养殖黄鳝肠道中筛选高产蛋白酶菌株，优化其发酵条件，为鳝源肠道益生菌的开发和应用奠定基础。1材料与方法1.1试验材料从仙桃市西流河镇购入5尾人工养殖的黄鳝，体重为（115.25±15.47）g。牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、NaCl 5 g，pH值7.2，加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。脱脂奶粉培养基：酵母粉5 g、NaCl 5 g、琼脂粉18 g、灭菌脱脂牛奶100 mL（10 g脱脂奶粉溶于100 mL蒸馏水），加蒸馏水至1 000 mL，121 ℃灭菌20 min。脱脂牛奶单独灭菌，铺制平板前再与其他成分混合，用于分离产蛋白酶菌。产蛋白发酵培养基：葡萄糖5 g、NaCl 1 g 、KH2PO4 0.5 g、MgSO4 0.3 g、蛋白胨10 g、(NH4)2SO4 1 g、CaCl2 1 g、H2O 1 000 mL，pH值7.2，121 ℃灭菌20 min。1.2试验方法1.2.1产蛋白酶菌株的筛选初筛：利用平板透明圈法[15-16]初筛黄鳝肠道产蛋白酶菌株。复筛：采用Folin-酚法测定菌株的酶活力。酶活力的定义：在pH值7.2、40 ℃条件下，每分钟水解1%酪蛋白产生1 μg酪氨酸的酶量为1个酶活力单位（U/mL）。酶活力高的菌株于-80 ℃冰箱保存。1.2.2药敏试验采用琼脂片扩散法进行药敏试验，将购自杭州微生物试剂有限公司的11种药敏片（恩诺沙星、新霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、多西环素、呋喃唑酮、氯霉素、红霉素、复方新诺明、庆大霉素和青霉素）贴于培养基表面（每个平皿中贴4片），每1种药敏片设置3个平行。在28 ℃的培养箱中倒置培养24 h，测量并记录抑菌圈的直径。抑菌圈直径大于15 mm为高敏，直径15~10 mm为中敏，直径小于10 mm为耐药[17]。1.2.3溶血试验参考宋梦思等[18]方法，将种子液稀释涂布于血平皿（青岛高科技工业园海博生物技术有限公司）中，28 ℃培养24 h，通过有无溶血圈判断菌株是否具有溶血能力。1.2.4菌株鉴定形态学及生理生化鉴定：将菌株接种培养24~48 h后，观察菌落的形态大小、隆起程度、边缘、表面、含水状态、菌落透明度、颜色等特征。参考《常见细菌系统鉴定手册》《伯杰氏细菌鉴定手册》，对未知菌株进行初步鉴定。分子生物学鉴定：采用CTAB法[19]提取菌株DNA，使用武汉擎科生物技术有限公司合成的引物16S-27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）以及16S-1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR扩增。PCR反应体系：2×PCR Mix 25 μL、DNA模板1 μL、上下游引物（10 μmol/L）各1 μL、去离子水22 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃变性30 s，72 ℃变性90 s，30个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增产物送武汉擎科创新生物科技有限公司测序，对序列进行BLAST分析，用MEGA 7.0以Neighbor-Joining Method构建系统发育树。1.2.5产蛋白酶菌株发酵条件优化（1）单因素试验。以吸光度为指标，利用单因素试验研究温度、时间、碳源和氮源对产蛋白酶活力的影响。碳源包括可溶性淀粉、碳酸氢钠、葡萄糖、乳糖和果糖，浓度均为10 g/L；氮源包括牛肉浸粉、尿素、酵母浸粉、氯化铵和蛋白胨，浓度均为5 g/L；温度为12、20、28、36、44 ℃；时间为12、24、36、48、60 h。试验设置3个重复。（2）正交试验。在单因素试验的基础上，进行3因素3水平的正交试验，每个试验组设置3个重复。L9(34)正交试验的因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平碳源（A）/(g/L)氮源（B）/(g/L)pH值（C）1556.0210107.0315158.01.3数据统计与分析采用SPSS 26对数据进行单因素方差分析，LSD法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1黄鳝来源肠道产蛋白酶菌株的筛选结果（见表2、图1）由表2可知，使用脱脂奶粉培养基从黄鳝肠道中筛选得到12株具有产蛋白酶活力的菌株。取dH/dC较大的4株菌进行复筛，因Ma-2菌株菌落较小，生长速度慢，故被筛除。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.T002表2黄鳝来源肠道产蛋白酶菌株的筛选结果菌株菌落直径（dC）/mm透明圈直径（dH）/mmdH/dCMa-10.401.403.50Ma-20.100.505.00Ma-30.150.402.67Ma-40.401.203.00Ma-50.491.803.67Ma-60.301.103.67Ma-70.601.302.16Ma-80.801.201.50Ma-90.801.201.50Ma-100.400.451.13Ma-110.601.302.16Ma-120.501.002.00注：黄鳝肠道来源菌株的命名为Ma-X。由图1可知，产蛋白酶的4株菌的酶活力排序为Ma-4（86.39 U/mL）Ma-1（66.74 U/mL）Ma-5（32.21 U/mL）Ma-6（21.46 U/mL）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F001图1黄鳝肠道中产蛋白酶菌株的酶活力2.2黄鳝产蛋白酶菌株药物敏感性试验结果（见表3）由表3可知，从黄鳝肠道中分离筛选出的4株产蛋白酶菌株对氯苯尼考等11种抗生素高度敏感。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.T003表3黄鳝肠道中产蛋白酶菌株的药敏试验结果抗生素名称每片含量/μgMa-1Ma-4Ma-5Ma-6抑菌圈/mm敏感性抑菌圈/mm敏感性抑菌圈/mm敏感性抑菌圈/mm敏感性氯苯尼考30.0037S37S35S43S青霉素6.0035S31S41S23S新霉素30.0023S25S27S27S氯霉素30.0033S31S37S33S恩诺沙星10.0039S37S39S37S环丙沙星30.0041S33S35S37S红霉素15.0031S25S31S25S多西环素30.0039S37S41S39S复方新诺明23.7533S29S33S33S庆大霉素10.0027S25S29S31S呋喃唑酮100.0029S27S31S27S注：R表示耐药，I表示中度敏感，S表示高度敏感。2.3黄鳝产蛋白酶菌株溶血试验结果（见图2）菌株代谢产物的溶血活性被认为是菌株安全性评价的重要指标[20]。由图2可知，菌株Ma-1、Ma-4、Ma-5和Ma-6均不释放溶血毒素，由此可以判断上述菌株不具致病性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F002图2黄鳝产蛋白酶菌株的溶血试验结果2.4黄鳝肠道中高产蛋白酶菌株Ma-4的鉴定结果（见表4及图3）筛选得到的菌株中，Ma-4菌株产蛋白酶活力最高，因此对其进行鉴定。菌株Ma-4为革兰氏阳性菌，具有芽孢。Ma-4能以葡萄糖为碳源，不能利用乳糖、蔗糖和纤维二糖等，不可利用七叶苷，VP反应均呈阴性，对明胶具有良好的水解作用，不产氧化酶，不产靛基质、H2S、赖氨酸脱羧酶、精氨酸双水解酶和鸟氨酸脱羧酶。通过测序，获得长度为1 416 bp的16S rRNA（GenBank登录号：OR342762）。BLAST结果显示，该菌株与阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）同源性为100%，鉴定其为阿氏芽孢杆菌[21-23]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.T004表4菌株Ma-4的生理生化试验结果项目结果项目结果项目结果项目结果葡萄糖+七叶苷-水杨素-H2S-乳糖-鸟氨酸脱羧酶-甘露糖-山梨醇-蔗糖-赖氨酸脱羧酶-甘露醇-葡萄糖磷酸盐-纤维二糖-精氨酸双水解酶-尿素-氧化酶-蕈糖-苯丙氨酸+过氧化氢+明胶+枸橼酸钠-蛋白胨水-靛基质试验-V-P试验-注：“+”代表“阳性”；“-”代表“阴性”。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F003图3基于16S rRNA基因序列的菌株Ma-4系统发育树2.5单因素发酵试验结果（见图4）由图4（a）可知，菌株Ma-4的酶活力在48 h处达到最大，说明本试验条件下，Ma-4菌株的最适发酵时间为48 h。由图4（b）可知，温度对菌株Ma-4发酵液的酶活力影响显著（P0.05），在36 ℃时其酶活力达到最高值，为97.90 U/mL，因此该菌株的最适发酵温度为36 ℃。由图4（c）可知，菌株Ma-4利用不同的碳源时，酶活大小依次为可溶性淀粉、乳糖、葡萄糖、果糖、碳酸氢钠。因此，可溶性淀粉为该菌株的最适碳源，菌株的酶活力值为88.30 U/mL。由图4（d）可知，菌株Ma-4利用不同氮源时，酶活大小依次为牛肉浸粉、蛋白胨、酵母浸粉、尿素、氯化铵。因此，牛肉浸粉为该菌株的最适氮源，菌株的酶活力值为63.46 U/mL。图4不同培养条件对菌株Ma-4酶活力的影响注：不同字母表示差异显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F4a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F4a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F4a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.F4a42.6正交试验结果在确定最适碳源和氮源的基础上，利用L9(34)正交试验进一步考察可溶性淀粉添加量（A）、牛肉浸粉添加量（B）和pH值（C）对菌株Ma-4产蛋白酶的影响，极差分析结果见表5，方差分析结果见表6。由表5可知，RCRARB，3个因素对产酶影响大小的顺序依次为pH值可溶性淀粉添加量牛肉浸粉添加量，与表6中的方差分析结果一致。最终确定最优方案为A3B3C1，即可溶性淀粉添加量15 g/L、牛肉浸粉添加量15 g/L和pH值6。验证试验结果表明，最适条件下蛋白酶活力为288.14 U/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.T005表5正交试验极差分析结果序号A/(g/L)B/(g/L)C酶活力/(U/mL)1556225.5125107178.673515872.5741057134.7351010873.46610156194.0571558111.78815106226.93915157245.85k1158.917157.340215.497k2134.080159.687186.417k3194.853170.82385.937R60.77313.483129.56010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.014.T006表6正交试验方差分析结果项目离均差平方和自由度均方F值F0.05值F0.01值P值总平方和206 989.8044模型178 429.00822 303.630 028.315 222.650A28 012.57214 006.280 017.781 463.2955.3360.001B1 556.962778.479 80.988 313.2955.3360.383C138 638.70269 319.370 088.003 313.2955.3360.001区组间3 354.684838.669 91.064 723.969模型误差10 220.7525 110.376 06.487 803.2955.3360.004试验误差25 206.1032787.690 53讨论3.1黄鳝肠道产蛋白酶菌株的筛选与鉴定分析本试验在对黄鳝产蛋白酶菌株进行初筛时，前肠菌株的dH/dC数值均大于或等于后肠菌株，说明前肠的肠道菌群较后肠具有更高的产蛋白酶能力，与张小立[24]的结果一致，说明黄鳝对食物的消化大多集中于前肠，其原因可能与黄鳝的肠道菌群结构有关。贺中华[25]认为，健康黄鳝前肠的肠道菌群种类比后肠多4种，而芽孢杆菌等能够产生大量的胞外消化酶，从而促进了黄鳝的生长[26]，这从菌群组成上证实了本试验中前肠酶活力远大于后肠的结果。本试验通过复筛得到4株高产蛋白酶菌株，最高酶活力为86.39 U/mL（Ma-4）。有研究结果表明，从牙鲆、鲈鱼和半滑舌鳎等肠道中筛选到产蛋白酶菌株，但其酶活力值均较低，分别为4.950、4.474、10.137 U/mL。酶活力数值相差较大可能与测定蛋白酶活力的方法不一致有关。如牙鲆和鲈鱼的研究中都是利用海水琼脂培养液25 ℃培养后，在30 ℃测定的酶活力[27-28]。虽然本试验与其他试验筛选的菌株均属于芽孢杆菌类，但本试验使用的是首次从黄鳝肠道中分离到的可产蛋白酶和过氧化氢酶的阿氏芽孢杆菌。阿氏芽孢杆菌在自然界中分布广泛，不仅可通过降解或合成大分子化合物来处理污水、改良土壤、降解农药和抵抗病害，还是一种植物根际促生菌，可促进植物生长[29-30]。目前，对阿氏芽孢杆菌的研究主要集中在农业、工业、食品和医疗领域[31]。3.2黄鳝肠道产蛋白酶菌株的安全性分析安全性试验结果表明，Ma-4菌株无溶血圈，说明其没有潜在的致病性，且对恩诺沙星等常见的11种抗生素高度敏感，是生产黄鳝肠道益生菌的安全候选菌株，优于其他研究筛选的菌株。宋梦思等[18]从两种对虾肠道筛选得到的3株产蛋白酶能力较强的菌，对青霉素、杆菌肽、头孢噻肟、奥格门汀及氨苄西林均有耐药性。刘树彬[32]从卵形鲳鲹肠道中筛选到的短小芽孢杆菌A97菌株虽不溶血，但对链霉素等11种抗生素药物具有较强的耐药性。因此，在水产行业有关益生菌的耐药性问题形成完善有效的评价标准和安全使用管理规范之前，选择更为敏感的水产益生菌并合理使用才更为妥善[33]。3.3黄鳝肠道产蛋白酶菌株的产酶特性分析从不同来源分离筛选不同菌株的最适发酵温度、最适pH值、接种量、培养基配方、培养时间、盐度、转速等均有差异[34-37]。因此，研究菌株Ma-4的最适发酵条件具有重要意义。菌株Ma-4的最适产酶温度为36 ℃，发酵时间为48 h，发酵培养基中可溶性淀粉添加量为15 g/L，牛肉浸粉添加量为15 g/L，pH值为6。优化后Ma-4菌株的产蛋白酶活力为288.14 U/mL，较优化之前提高了3.34倍。若想进一步提高产蛋白酶菌株的产酶能力，可以使用紫外线、粒子束等物理诱变，也可以用碱基类似物等化学诱变。胡悦等[38]采用氯化锂常压室温等离子体复合诱变筛选获得高产菌株F-3，碱性蛋白酶酶活提高75%。卢超等[39]利用紫外线和亚硝酸钠复合诱变筛选，得到高产中性蛋白酶菌株L01F，酶活力提高了2.61倍，达到577.87 U/mL。4结论本研究从黄鳝肠道筛选得到1株高产蛋白酶菌株Ma-4，经鉴定其为阿氏芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）。阿氏芽孢杆菌具有良好的生物安全性，对多种抗生素均为高度敏感，且不会产生溶血毒素。在温度36 ℃、发酵时间48 h、可溶性淀粉添加量15 g/L、牛肉浸粉添加量15 g/L、pH值6.0的条件下，Ma-4的产酶活力最高，为288.14 U/mL。该菌株可作为黄鳝肠道益生菌开发与应用的候选株进行深入研究。