酒石酸泰乐菌素是大环内酯类抗生素中的一种，其主要作用为杀菌[1]，可防止动物感染支原体[2]和革兰氏阳性菌[3]等病原微生物，但一定程度上会影响动物的生长发育。目前，酒石酸泰乐菌素作为兽药广泛用于动物生产中[4-6]。酒石酸泰乐菌素作为一种药物，对其进行质量控制尤为重要。测定酒石酸泰乐菌素含量的方法包括微生物抗生素法[7-8]、高效液相色谱法[9-11]及紫外分光光度法[12-14]等。孔雀石绿因具有杀菌性能，被广泛用于水产养殖及运输领域[15-16]。孔雀石绿尚未被用于测定酒石酸泰乐菌素的含量。共振光散射光谱法是一种快速检测技术，因具有操作简便、灵敏度高以及耗时短等优点而被广泛使用[17-18]。本文采用孔雀石绿共振光散射光谱法检测酒石酸泰乐菌素的含量，为酒石酸泰乐菌素质量的控制提供参考。1材料与方法1.1主要试剂与仪器孔雀石绿，分析纯，浓度2×10-4 mol/L，固镇县千禾化工有限公司；酒石酸泰乐菌素可溶性粉，20 g/袋，回盛生物科技有限公司；注射用酒石酸泰乐菌素，2 g/瓶，合肥中龙神力动物药业有限公司；试验用水为去离子水。F-7000荧光分光光度计（日本日立公司），FA2204N分析天平（上海高致精密仪器有限公司）。1.2试验方法在10 mL的比色管中，分别加入适量的酒石酸泰乐菌素标准溶液（5.0 mg/L）、1.50 mL pH 值6.6的Clark-Lubs缓冲溶液以及1.00 mL孔雀石绿溶液，加水定容，即为反应溶液。将反应溶液与空白溶液分别置于荧光分光光度计中，进行同步扫描，并令发射波长（λem）和激发波长（λex）同时为285 nm或332 nm，得到反应溶液的散射强度（I）和空白溶液的散射强度（I0），计算强度差（ΔIRLS）。ΔIRLS=I0-I。(1)试验条件优化的步骤与上述试验方法一致，只定量考察各具体条件优化的量，以确定最优条件。1.2.1工作曲线的确定分别准确移取5.0 mg/L的酒石酸泰乐菌素标准溶液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL，采用“1.2试验方法”，得到图谱，计算强度差。1.2.2回收率的确定在1 000 mL容量瓶中加入酒石酸泰乐菌素的模拟可溶性粉适量，加水溶解并定容，得到浓度为5.0 mg/L的待测液。准确移取0.80 mL待测液，按照“1.2试验方法”，平行测定10次，得到共振光散射强度差。1.2.3样品分析在1 000 mL的容量瓶中加入0.100 0 g的注射用酒石酸泰乐菌素，加水溶解并定容，配制100.0 mg/L的样品原液。将样品原液用超纯水稀释20倍，测定其共振光散射强度差值，平行测定6次。2结果与分析2.1酒石酸泰乐菌素共振光散射图谱（见图1）由图1可知，空白溶液的共振光散射图谱能够产生明显的共振光散射现象，且其最大峰分别位于285 nm和332 nm处。加入酒石酸泰乐菌素溶液后，明显减弱了共振光散射强度。原因主要是酒石酸泰乐菌素溶液以泰乐菌素形式存在，泰乐菌素作为电子给予体，与电子接受体阳离子染料孔雀石绿发生电荷转移反应，生成了电荷转移配合物，消耗了体系中的孔雀石绿，从而导致体系的散射光强度减弱。当波长为285 nm和332 nm时，共振光散射强度（IRLS）达到最大。由于共振光散射强度具有加和性，因此将波长285 nm和332 nm以及双波长叠加法作为本试验的检测波长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F001图1共振光散射图谱2.2体系中条件优化的结果2.2.1Clark-Lubs缓冲溶液pH值对体系共振光散射强度的影响（见图2）由图2可知，体系的强度差ΔIRLS达到最大时，pH值为6.60，选择pH值6.60的Clark-Lubs缓冲溶液作为反应介质。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F002图2Clark-Lubs缓冲溶液pH值对体系共振光散射强度的影响2.3Clark-Lubs缓冲溶液用量对共振光散射强度的影响（见图3）由图3可知，强度差ΔIRLS达到最大时，缓冲溶液体积为1.50 mL，故选择1.50 mL的Clark-Lubs缓冲溶液作为反应试剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F003图3Clark-Lubs缓冲溶液用量对共振光散射强度的影响2.4孔雀石绿用量对共振光散射强度的影响（见图4）由图4可知，强度差ΔIRLS达到最大时，阳离子染料孔雀石绿用量为1.0 mL，故选择1.0 mL阳离子染料孔雀石绿作为反应试剂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F004图4孔雀石绿用量对共振光散射强度的影响2.5反应时间对共振光散射强度的影响（见图5）由图5可知，强度差ΔIRLS达到最大时，反应时间为15 min，15 min后呈下降的趋势，故最佳反应时间为15 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F005图5反应时间对共振光散射强度的影响2.6工作曲线和检测限按照“1.2.1工作曲线的试验方法”测定不同浓度的酒石酸泰乐菌素共振光散射图谱（见图6）。根据图6绘制工作曲线（见图7），检测限见表3。由测定结果可知，单波长法和双波长叠加法均具有很高的灵敏度，而且宽线性范围、线性关系良好，特别是双波长叠加法的检测限是单波长检测限的2倍。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F006图6不同浓度酒石酸泰乐菌素溶液的共振光散射光图谱10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F007图7工作曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.T001表3工作曲线的线性方程检测方法λ/nm线性回归方程线性范围/(mg/L)R检测限/(mg/L)单波长285∆IRLS=3 020c-358.60.2~0.60.999 60.008 5332∆IRLS=2 279c-407.80.2~0.60.999 60.008 7双波长叠加285+332∆IRLS=5 299c-766.40.2~0.60.999 80.004 12.7抗干扰试验考虑到酒石酸泰乐菌素样品中会存在一些物质干扰本试验，因此在最佳试验条件下考察11种物质对本体系共振光散射强度的影响，结果见表4。由表4可知，11种物质测定的相对误差均不超过±5%，说明这11种物质对采用双波长叠加法测定酒石酸泰乐菌素的测定结果无明显干扰，试验验证了本方法具有良好的选择性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.T002表4抗干扰试验结果序号干扰物质干扰物/被测物（最大倍数）测定误差/%1L-亮氨酸20-2.672甘氨酸20-0.953Mg2+501.384山梨酸80-4.385葡萄糖80-1.526蔗糖80-3.817DL-丙氨酸800.768可溶性淀粉2000.959K+2002.6710Na+200-4.7611Cl-2001.502.8回收试验（见表5）由表5可知，当采用双波长叠加法时，酒石酸泰乐菌素的回收率为98.91%~100.6%，平均回收率是99.82%，RSD是0.51%。因此，本方法能够满足分析工作的要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.T003表5双波长叠加法的回收率次数浓度/(mg/L)测定浓度/(mg/L)回收率/%平均回收率/%RSD/%10.400.400 099.9999.820.5120.400.399 299.8030.400.402 4100.6040.400.398 599.6150.400.396 699.1460.400.399 499.8570.400.395 698.9180.400.400 3100.1090.400.401 3100.30100.400.399 499.852.9样品分析按照“1.2.3样品分析试验方法”计算注射用酒石酸泰乐菌素的含量，并与紫外分光光度法[11]进行比较，结果见表6。由表6可知，两种方法的相对误差均较小，且对样品含量的检测结果基本一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.T004表6样品中酒石酸泰乐菌素含量的分析结果样品双波长叠加共振光散射法紫外分光光度法[11]平均测定值/(g/瓶)相对于标示量的平均含量/%RSD/%平均测定值/(g/瓶)相对于标示量的平均含量/%RSD/%12.012100.601.692.010 0100.501.9821.99999.930.592.006 0100.030.603讨论研究发现，孔雀石绿空白溶液能够产生强烈的共振光散射现象。这是因为孔雀石绿是一种由孔雀石绿阳离子与草酸氢根阴离子组成的有机酸盐，在试验条件下草酸氢根阴离子转化为草酸根二价阴离子[19-20]。1个孔雀石绿阳离子上的叔胺氮原子与水分子形成氢键，水分子与草酸根二价阴离子上一端氧负离子形成氢键，而草酸根的另一端氧负离子与第二个孔雀石绿阳离子依靠静电引力形成离子缔合物[21-23]，第二个孔雀石绿阳离子上的叔胺氮原子和水分子形成氢键，形成了以离子缔合和氢键同时构筑的超分子聚合物[24-25]，从而引起强烈的共振光散射，见图8（a）。图8共振光散射现象发生机理10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F8a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.022.F8a2本试验中，酒石酸泰乐菌素因泰乐菌素叔胺上的氮原子拥有孤对电子，泰乐菌素可作为电子给予体，与阳离子染料孔雀石绿（电子接受体）发生反应，形成电荷转移配合物，见图8（b）[26-29]，从而使体系共振光散射强度显著减弱[30-32]，导致孔雀石绿所构筑的超分子聚集体分解，故而明显减弱了体系共振光散射强度。4结论试验选用阳离子染料孔雀石绿检测酒石酸泰乐菌素含量。试验结果表明，在pH值6.60的条件下，酒石酸泰乐菌素与孔雀石绿发生电荷转移，使体系的共振光散射强度减弱。本试验采用将其两个单波长的∆IRLS进行叠加，提高了分析的灵敏度。