粗纤维（CF）的含量是饲料营养成分分析中的重要指标。饲粮中一定含量的粗纤维对动物有正效应，但过高粗纤维含量不利于动物对饲料的消化，且不同性能及来源的粗纤维对动物有不同的影响[1]。李春黎等[2]、吴昊等[3]、董振寰[4]报道，利用米根霉单菌或多菌混合发酵会产生纤维素酶以降解纤维素。但万茵等[5]利用米根霉发酵豆渣，发现发酵豆渣中膳食纤维含量由0.25%提高10.5%。吴学凤等[6]利用米根霉、里氏木霉和黑曲霉发酵小麦麸皮，发现利用3种菌发酵后小麦麸皮不溶性膳食纤维（IDF）增加19%~32%。IDF主要包含纤维素、半纤维素、木质素、几丁质、壳聚糖和植物蜡[7]。用酸、碱等洗涤剂除去样品中的糖、淀粉、蛋白质等物质，不能消化的残渣即为IDF[8]。CF主要含纤维素，还有少量半纤维素和木质素，CF测定的现行国家标准是GB/T 6434—2006《酸碱醇醚处理法》[9]，与IDF测定原理基本相同。推测真菌在发酵时产生的大量菌丝体的结构性物质在IDF或CF测定时无法被酸碱等洗涤剂去除，导致测定时发酵产品的IDF或CF增加。张良雨等[10]、江贤君等[11]应用Elson-Morgan法分别测定白地霉和黑曲霉的生物量，研究两种真菌的固态发酵过程。文章采用米根霉固态发酵麦麸，应用Elson-Morgan法测定发酵基质中米根霉的含量，检测发酵基质中粗纤维总量是否会因米根霉菌丝的增加而上升；并通过检测固态发酵饲料中米根霉菌丝含量及其粗纤维含量，以排除米根霉等真菌菌丝对固态发酵饲料粗纤维检测的影响，以期为固态发酵饲料中粗纤维含量检测提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种米根霉（Rhizopus oryzae，W3）、酵母（Candida utilis，Y5a）、佛州侧耳(Pleurotus floridanus，JAUCC0916 )、哈茨木霉（Trichoderma harzianum，JAUCC0684）保藏于本实验室。1.1.2培养基PD液体培养基：去皮马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值自然。PDA固体培养基：琼脂20 g/L，pH值自然。菌丝富集麦麸培养基：已烘干500 g麦麸加入500 mL蒸馏水，高压灭菌后铺平于方形塑料盆（40 cm×30 cm×10 cm）中，封口膜封口。固态发酵麦麸培养基：烘干的麸皮25 g、蒸馏水25 mL，pH值自然，装入烘干的250 mL锥形瓶中，并标记好每个锥形瓶的重量。YPD培养基：酵母浸粉10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1 000 mL，pH值6.6~6.8。培养基121 ℃灭菌20 min，方形塑料盆用75%酒精表面擦拭，置于无菌负压实验室紫外线杀菌2 h，24 h后紫外线再次杀菌2 h。1.1.3主要试剂与仪器氨基葡萄糖盐酸盐、乙酰丙酮、对二甲氨基苯甲醛、几丁质购自aladdin公司，其他试剂均为国产分析纯。电子分析天平购自德国赛多利斯集团；SNP-1500型生化培养箱购自上海精宏实验设备有限公司；SW-CJ-1D型超净作台购自江苏苏洁净化设备厂；SKY-2112B型恒温双层摇床购自上海苏坤仪器仪表有限公司；HH6数显恒温水浴锅购自国华电器有限公司；MLS-375-PC高压蒸汽灭菌器购自松下健康医疗器械株式会社；UV2600紫外可见分光光度计购自日本岛津公司；LXJ-IIB低速大容量多管离心机购自上海安亭科学仪器厂；15 L发酵罐购自上海国强生化工程装备有限公司。1.2试验方法1.2.1氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线的测定氨基葡萄糖盐酸盐标准溶液制备：取1 mmol/L的氨基葡萄糖盐酸溶液5、10、20、30、40、50 mL，分别加蒸馏水定容至100 mL，制成0.05、0.10、0.20、0.30 、0.40 、0.50 mmol/L的氨基葡萄糖盐酸盐溶液。以Elson-Morgan法[12-13]测定不同浓度氨基葡萄糖盐酸盐溶液在530 nm下测吸光值，以蒸馏水为空白。1.2.2米根霉分生孢子与不同培养方法菌丝的制备米根霉分生孢子悬液的制备：将保藏于PDA斜面培养基的米根霉转接至新制得PDA斜面培养基中，30 ℃培养60 h，待菌丝长满整个斜面产生大量孢子后，每支试管加入10 mL的无菌水，洗下孢子后过滤掉菌丝，制得孢子液，用血球计数板确定孢子的浓度，用无菌水调整孢子浓度为108 个/mL，获得孢子悬液。菌丝收集：（1）PD液体培养并收集米根霉菌丝：取上述孢子悬液30 mL，接入装有600 mL PD液体培养基锥形瓶（容量为1 L）中，摇床150 r/min，做7组重复，30 ℃培养箱培养7 d，每天用砂布过滤1组菌液以收集菌丝。（2）PDA平板培养收集米根霉菌丝：取上述孢子悬液0.5 mL，接入直径200 mm的PDA平皿培养基中并涂布均匀，30 ℃培养7 d，每天刮取菌丝。（3）麦麸培养收集米根霉菌丝：取上述孢子悬液50 mL接入菌丝富集麦麸培养基中，用无菌玻璃棒搅拌均匀，30 ℃培养箱培养7 d，由于麦麸中生长的米根霉菌丝分离难度大，只在第2、4、6 d用无菌接针挑取生长于麦麸培养基表面的菌丝（去除麦麸）。将所有收集到的米根霉菌丝于105 ℃烘干至恒重，菌丝经粉碎或研磨后过40目筛，制得米根霉纯菌丝粉末，并测定米根霉纯菌丝的氨基葡萄糖（GA）和粗纤维（CF）含量。1.2.3纯米根霉菌丝中GA含量和CF含量的测定用万分位电子天平准确称取1.2.2不同培养方法制备的菌丝粉末0.1 g，分别装入50 mL离心管中，每支离心管加入浓盐酸10 mL，60 ℃水浴2 h[14]，冷却后用5 mol/L的NaOH中和至pH值7.0，定容至100 mL。按照Elson-Morgan法测定定容后溶液的吸光度OD530 nm，以计算不同培养方式制备的米根霉菌丝中GA含量，并测定的菌丝的CF含量。CF含量检测参照GB/T 6434—2006《饲料中粗纤维的含量测定 过滤法》[9]。准确称取第4 d PDA平板生长的米根霉菌丝粉末0.04、0.08、0.12、0.16、0.20、0.24 g，分别装入50 mL离心管中，每支离心管加入浓盐酸10 mL，60 ℃水浴2 h，用NaOH中和至pH值7.0，定容至100 mL。采用Elson-Morgan法测定定容后溶液的OD530 nm，根据氨基葡萄糖标准曲线计算出氨基葡萄糖含量；再以米根霉纯菌丝质量为横坐标，氨基葡萄糖含量为纵坐标，绘制氨基葡萄糖与米根霉纯菌丝质量的关系曲线。单位干基GA含量(mmol/gds)=(0.406 6×OD530 nm－0.006 3)/10(1)1.2.4米根霉固态发酵麦麸1.2.4.1米根霉菌落计数培养基湿重的测定：取1.2.2获取的孢子悬液2.5 mL接种于固态发酵麦麸培养基中，置于30 ℃培养箱，培养6 d，每天取样1次，每次取6个样品，称量，即为总湿重。其中3个样品烘干后用于测定其水分，并计算出总干重，其余3个样品用于米根霉菌落计数。总干重＝总湿重×(1－水分)(2)培养基水分的测定：已测定湿重的6个样品中随机抽取3个样品，放入105 ℃烘箱烘至恒重，称量，即为干重。样品水分含量=[(湿重－干重)/湿重]×100%(3)米根霉菌落计数：参照GB 4789.15—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》[15]，检测已测定总湿重的3个样品米根霉活菌量。1.2.4.2米根霉生物量的计算将1.2.4.1中烘干的固态发酵麦麸培养基样品粉碎过40目筛，得到样品粉末。用万分位天平准确称量每天的样品1 g。按照1.2.3的方法测定其吸光度，重复3次，以灭菌后的0 d麦麸培养基为空白，根据氨基葡萄糖标准曲线计算固态发酵基质中的氨基葡萄糖含量。单位干基米根霉含量(g/gds)=单位干基氨基葡萄糖含量(mmol/gds)/单位干重纯米根霉菌丝氨基葡萄糖含量(mmol/gds)(4)1.2.4.3发酵过程中CF含量分析测定1.2.4.1中烘干并粉碎得到的固态发酵麦麸培养基样品粉末粗纤维含量，并计算出样品中米根霉菌丝中的CF含量。样品中米根霉总量(g)=单位干基中米根霉含量(g/gds)×总干重(g)(5)A：样品CF总量(g)=样品总干重(g)×样品的CF含量(%)(6)B：米根霉中CF总量(g)=样品中米根霉总量(g)×不同阶段纯米根霉CF含量(%)(7)A－B(g)=样品中CF总量(g)－样品中米根霉的CF总量(g)(8)1.2.5酵母菌体、佛州侧耳与哈茨木霉菌丝的制备将保藏的产朊假丝酵母菌种经YPD斜面活化，三角瓶扩培，在15 L发酵罐中培养，28 ℃、150 r/min，培养48 h，然后将发酵液利用低速大容量离心机，5 000 r/min离心20 min获得产朊假丝酵母菌菌体，置于105 ℃烘箱，烘干至恒重后粉碎过40目筛制得酵母菌体粉末。将保藏于冰箱的佛州侧耳和哈茨木霉接种于新制的PDA平板培养基活化，随后转接至含PDA培养基直径为200 mm的平皿内，28 ℃培养7 d，分别刮取佛州侧耳菌丝和哈茨木霉菌丝，将刮取的菌丝至于105 ℃烘箱，烘干至恒重后粉碎过40目筛，制得佛州侧耳菌丝粉末和哈茨木霉菌丝粉末。测定酵母菌体、佛州侧耳菌丝和哈茨木霉菌丝的粗纤维含量，同时测定纯几丁质的粗纤维含量，并与米根霉菌丝的粗纤维含量进行比较。1.3数据统计与分析数据使用Microsoft Excel 2016整理。应用DPS 7.5统计软件进行数据分析，各组间比较采用单因素试验统计分析，P0.05表示差异显著。使用Graphpad prism 5软件作图。2结果与分析2.1氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线（见图1）由图1可知，氨基葡萄糖盐酸盐浓度与吸光度的关系式为：y=0.406 6x-0.006 3，R2=0.995 9，氨基葡萄糖盐酸盐浓度测定范围为0~0.5 mmol/L，OD530 nm的测定范围0~1.245。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.021.F001图1氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线2.2菌丝中氨基葡萄糖含量和米根霉纯菌丝质量的关系（见图2）几丁质是真菌细胞壁组成成分，几丁质在未完全水解的条件下存在很多低聚糖，此时测定的GA含量会比完全水解的条件下测定的值小。因此要尽量使得几丁质完全水解。许创伟等[14]报道，几丁质经浓盐酸处理可以完全水解成氨基葡萄糖，因此可以使用浓盐酸处理以提取米根霉菌丝中的氨基葡萄糖。由图2可知，菌丝中氨基葡萄糖含量和米根霉纯菌丝质量关式为：y=0.174 6x，R2=999 9。说明在本试验条件下用浓盐酸处理不同质量的米根霉菌丝提取得到的氨基葡萄糖含量是稳定的；米根霉菌丝质量与其氨基葡萄糖含量的呈线性正相关，一定生长时间的米根霉菌丝中氨基葡萄糖含量是恒定的，与江贤君等[11]研究结果一致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.021.F002图2菌丝中氨基葡萄糖含量和米根霉纯菌丝质量的关系2.3不同培养方法对菌丝的GA、CF含量的影响（见图3）由图3可知，在液体培养基生长的菌丝与麦麸培养基生长的菌丝的GA含量和CF含量差异显著，液体培养基GA含量1~4 d比麦麸培养基低很多，5~6 d比麦麸培养基要高很多，CF含量比麦麸培养基生长的菌丝低很多。PDA平板固体培养的菌丝与麦麸培养基生长的GA含量比较接近，两者GA含量的变化趋势是比较一致的，CF含量变化趋势略有不同；第2 d麦麸生长菌丝比平板生长菌丝CF含量要低，4 d和6 d麦麸生长的菌丝和平板生长的菌丝CF含量比较接近。米根霉在麦麸中生长过程基本与在PDA平板上生长相似，菌丝生长从白色→灰白→灰褐色（菌丝成熟）。在PDA平板上2 d菌丝变成灰褐色，而麦麸中米根霉生长更慢一些，3 d开始转变成灰褐色，这种生长速度的不同导致生长前期CF含量有所不同，但菌丝成熟后（4~6 d）二者无明显差异。试验表明，液体培养与固体培养的米根霉菌丝中GA和CF含量有显著差异；PDA平板和麦麸固体培养的米根霉GA含量和变化趋势是比较一致的，在菌丝生长前期时CF含量差异较大，菌丝成熟后CF含量无明显差异。图3不同培养方法对菌丝GA、CF含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.021.F003（a）不同培养方法对菌丝GA含量的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.021.F004（b）不同培养方法对菌丝CF含量的影响2.4固态发酵过程中麦麸培养基的米根霉含量与活菌量的比较（见图4）由图4可知，在固态发酵基质中米根霉含量在1~2 d缓慢上升，2~4 d呈直线上升，5 d以后略有下降。米根霉活菌量在0~2 d上升缓慢，2~4 d呈直线上升，4 d以后迅速下降，说明1~4 d基质中米根霉含量与米根霉活菌量具有较高的相关性。5~6 d后两者存在一定的差异。国标法稀释样品过程中由于米根霉菌丝与麦麸培养基结合较紧密，无法与培养基完全分离，菌丝不能与稀释液充分混匀，导致菌落计数中主要计算的是米根霉的分生孢子数量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.021.F005图4固态发酵过程中麦麸培养基的米根霉含量与干重活菌量的比较Elson-Morgan法测定的是固态基质中米根霉氨基葡萄糖含量。由于培养基中未降解的死菌细胞也含有氨基葡萄糖，所以Elson-Morgan法检测米根霉生物量包含活菌和死菌。第4 d后，米根霉产孢子能力严重下降，但存在大量未降解的死菌，故而米根霉含量下降缓慢。未降解的死菌与活菌一样含有大量的细胞结构性物质，如果基质中粗纤维含量增加是菌丝的细胞结构性物质引起，那么测定固态基质中米根霉生物量时应包含活菌和死菌。因此，与国标平板计数法相比，Elson-Morgan法能更好地测定米根霉的生物量。2.5米根霉固体发酵中CF含量分析（见表1）以麦麸培养基纯米根霉菌丝4 d和6 d的CF含量的平均值33.36%，用于计算固态发酵麦麸培养基4~6 d生长的米根霉菌丝CF含量。由表1可知，在米根霉固态发酵麦麸的过程中培养基的干重是逐步下降解的，4~6 d固态发酵麦麸培养基的CF含量为15.06%~15.46%，远大于初始麦麸的CF含量8.62%；固态发酵麦麸培养基中米根霉质量分数为20.35%~22.52%；米根霉菌丝的CF总量占麦麸培养基粗纤维总量的45.09%~48.00%；麦麸培养基中CF总量减去米根霉菌丝所含粗纤维总量后，远低于初始麦麸培养基的CF总量，说明米根霉可以有效地降解利用麦麸中的粗纤维（CF）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.021.T001表1米根霉固体发酵中CF含量分析项目0 d4 d5 d6 d样品总干重/g25.00±0.03a19.42±0.55b18.87±0.20c18.28±0.06d样品CF含量/%8.62±0.33d15.46±0.35b15.90±0.45a15.06±0.54c样品中米根霉总量/g0d4.32±0.07a4.25±0.06b3.72±0.08cA：样品中CF总量/g2.16±0.08c3.00±0.02a3.00±0.05a2.75±0.09bB：样品中米根霉的CF总量/g0c1.44±0.02a1.41±0.01a1.24±0.02bA－B/g2.16±0.08a1.56±0.02b1.59±0.07b1.51±0.11b注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.6酵母菌体与几种真菌菌丝粗纤维含量的比较按照GB/T 6434—2006《饲料中粗纤维的含量测定 过滤法》测得的产朊假丝酵母菌体（2 d）、佛州侧耳菌丝（7 d）、哈茨木霉菌丝（7 d）、几丁质的粗纤维含量分别为1.63%、14.38%、17.14%、83.49%，米根霉菌丝（麦麸固态培养4~6 d）的粗纤维含量为33.36%。测得佛州侧耳、米根霉和哈茨木霉的粗纤维含量比酵母的粗纤维的含量高很多，可能与真菌细胞壁的中的纤维素和几丁质含量有很大关系。酵母菌的细胞壁成分以葡聚糖为主，含有少量几丁质；真菌细胞壁的主要成分是多糖，几丁质是多数真菌细胞壁的组成成分，约占真菌细胞壁干重的35%；低等真菌以纤维素为主，高等陆生真菌以几丁质为主，霉菌的细胞最内层由几丁质微纤维丝组成，厚度达18 nm[16]。3讨论米根霉可以将半纤维素降解物用于几丁质、壳聚糖以及菌体蛋白等细胞组分的合成[17]；米根霉代谢木糖时产生较高的胞内还原力及ATP，促使细胞生物量的合成以及细胞大分子组分的合成[18]。李鑫等[19]从米根霉菌体中提取了大量的黏度为3.1~6.1 mPa·s壳聚糖（几丁质脱乙酰化产物）。刘平[20]在裂褶菌接种量10%、麦麸添加量4%、含水量60%情况下，对甘蔗渣进行固态发酵，发现第8 d IDF比未发酵的培养基增加143.8%。王宏勋等[21]采用灵芝固态发酵玉米皮获得膳食纤维，发现接种种龄在对数生长期前的菌种以及添加KH2PO4和MgSO4能够从总体上提高IDF的组分含量。袁惠君等[22]猜测菌丝的细胞结构性物质可能作为膳食纤维成分在提取过程中保留下来，引起提取的膳食纤维含量增加。因此，国标法测定粗纤维时无法去除真菌细胞结构中的几丁质和纤维素等物质，并推测真菌的细胞结构性物质，主要可能是细胞壁中的纤维素和几丁质会提高发酵样品中的粗纤维含量。4结论米根霉菌丝含量对固态发酵过程中基质的粗纤维测定值影响较大。固态发酵过程中麦麸培养基的粗纤维含量的升高是由米根霉菌丝大量生长引起。研究推测国标法测定粗纤维时无法去除真菌细胞结构中的几丁质和纤维素等多聚糖类物质，并推测细胞壁中的纤维素和几丁质等多聚糖类物质会提高固态发酵产品中粗纤维的含量。研究通过检测米根霉固态发酵饲料中米根霉菌丝含量及其粗纤维含量，以排除米根霉等真菌菌丝对固态发酵饲料粗纤维检测的影响，使得检测结果更加客观和准确。