沙棘属于胡颓子科属落叶性灌木果实，具有耐旱、耐盐碱、抗风沙的特性，主要用于我国西北地区的沙漠绿化，也是北方的特色农作物[1]。沙棘富含维生素、多糖、蛋白质、氨基酸、微量元素等营养成分，以及黄酮类、甾体类化合物、原花青素、三萜烯类等生物活性物质，具有药食同源的特性[2-4]。沙棘籽中营养代谢物是果汁的两倍多[5]，沙棘叶中活性提取物中存在抗炎活性成分[6]，具有抗炎和抗氧化性能[7-8]，沙棘果皮可作为天然的增稠剂和乳化剂[9]。沙棘果实多被用于深加工，而大量的枝叶和果渣在加工过程中作为不可食用的部分被去除，造成了资源的浪费。大肠杆菌是一种人畜共患的病菌。抗生素的不规范使用会使大肠杆菌产生耐药性。在畜禽业饲料端全面禁抗的环境下，植物活性提取物替代抗生素成为研究的热点。研究表明，浆果副产品的活性提取物能够抑制大肠杆菌[10]和沙门氏菌[11]活性。因此，本研究采用不同提取方法提取沙棘副产品中的活性成分，研究滤纸片法、打孔法和常量肉汤稀释法对大肠杆菌的抑菌效果，为沙棘副产品在动物生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料及仪器设备沙棘副产品由阿合奇中科沙棘有限公司工厂提供，硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠、无水乙醇、石油醚（天津永大化学试剂有限公司）。芦丁标准品（纯度95%）和大肠杆菌ATCC29213购自上海源叶生物科技有限公司。溶菌肉汤（LB）培养基：胰蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、氯化钠10 g/L。水解酪蛋白琼脂（MH）培养基：酪蛋白水解物17.5 g、牛肉浸膏粉17.5 g、淀粉2 g、琼脂1.5 g，pH值7.1~7.5。培养基均购自青岛海博生物科技有限公司。超声波清洗器（KQ-500DE，昆山舒美超声仪器有限公司）、旋转蒸发器（RE-52AA，上海亚荣生化仪器厂）、恒温数显水浴锅（HH-S2，江苏金怡仪器科技有限公司）、台式真彩触摸屏振荡器（ZWYR-200D，上海智城分析仪器制造有限公司）、紫外可见分光光度计（TU-1810，北京普析通用仪器有限责任公司）。1.2试验方法1.2.1沙棘副产品营养成分的测定常规营养成分的测定参考《饲料分析及饲料检测技术》进行[12]，其中干物质（DM）含量采用105 ℃烘干法测定，粗灰分（Ash）含量采用马弗炉灼烧法测定，粗蛋白（CP）含量采用全自动凯氏定氮法测定，粗脂肪（EE）含量采用全自动脂肪分析仪测定，中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量采用范氏洗涤纤维法测定，钙（Ca）和磷（P）含量采用高锰酸钾滴定法测定。1.2.2瘤胃体外发酵试验（1）培养液制备及发酵试验。试验设置0、3%、5%、8%、11%、15%共6个沙棘副产品添加水平，每组5个重复，设置3、6、9、12、24、36、48 h 7个发酵时间点。于晨饲后2 h采集瘘管羊瘤胃液，将瘤胃液经4层纱布过滤，并装于通有CO2保温壶带回实验室，置于39 ℃恒温水浴锅内，持续通入CO2以维持厌氧环境。人工瘤胃缓冲液参考BIANCO等[13]的方法配制，缓冲液∶瘤胃液配比为2∶1。（2）产气量及产气参数测定。分别记录培养3、6、9、12、24、36、48 h时的产气体积，根据ØRSKOV等[14]动态发酵参数模型公式计算累积产气量。GP=a+b(1-exp-ct)(1)式中：GP为累积产气量（mL）；t为发酵时间（h）；a为快速降解部分产气量（mL）；b为慢速降解部分产气量（mL）；c为产气速率（%/h）。1.2.3不同提取方法中沙棘副产品活性成分（1）醇提法。沙棘副产品提取时料液比为1∶20，加入60%乙醇，浸泡24 h。超声波100%，40 ℃，30 min，真空抽泵过滤滤渣。旋转蒸发仪中60 ℃提取液体5 h[15-16]。最终料液比为1∶1，0.45 μm滤膜过滤，-20 ℃保存。（2）水提法。将沙棘副产品60 ℃烘干2~3 h，取20 g放入烧杯中，加水500 mL，煮沸，转中小火熬至200 mL，加水至500 mL，煮沸，转中小火，熬至200 mL，重复3次，小火收缩至100 mL，纱布过滤滤渣，收集提取液[17]。收缩使料液比达到为1∶1，0.45 μm滤膜过滤，0 ℃保存。1.2.4菌液的制备将活化好的大肠杆菌划线接种于牛肉膏蛋白胨培养基，置于37 ℃恒温培养箱中培养24 h；用接种环挑取单个菌落至10 mL的LB肉汤中，37 ℃振荡培养至0.5麦氏浊度（相当于5×107～5×108 CFU/mL），即为供试菌液[4,18]。1.2.5黄酮含量测定采用亚硝酸钠-硝酸铝法，在540 nm波长测定标准品芦丁的吸光度[19]，绘制标准曲线。1.2.6抑菌试验（1）滤纸片法。吸取100 μL的0.5麦氏比浊菌液，涂布于牛肉膏蛋白胨培养基上，室温干燥5 min。用镊子夹取药敏纸片贴在平皿表面，每个平皿贴2片药敏纸片（同种药材的醇提取物和水提取物各1片）。1片含10 μg庆大霉素的药敏纸片作为阳性对照，1片用无菌水处理过的纸片作为阴性对照，做3组平行试验。37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺以不同方向测量抑菌圈直径，记录数据并取平均值[20-21]。抑菌圈小于10 mm为轻度抑菌，记录为“+”；抑菌圈直径10～15 mm为中度抑菌，记录为“++”；抑菌圈直径大于15 mm为高度抑菌，记录为“+++”[22]。（2）打孔法。配置固体培养基，在无菌固体培养基上涂布大肠杆菌，用1 mL无菌枪头于固体培养基上打孔，每个平皿5孔，每个孔依次加入沙棘副产品提取液10、20、30、40、50 μL，用无菌水补充其他孔至50 μL。对照组加入50 μL无菌水和50 μL庆大霉素，37 ℃培养箱过夜。（3）常量肉汤稀释法。设置每组8管，3组平行，2个对照，配制液体培养基。用生理盐水配制0.5麦士比浊大肠杆菌200 mL，第一支试管加入2 mL沙棘副产品提取液，移取2 mL加入第二支试管，依次直至最后一支试管，最后一支试管去掉2 mL，此时每组试管中提取物含量依次为500、250、125、62.5、31.25、15.625、7.812 5、3.906 3 g/L。每管加入2 mL 0.5麦氏生理盐水配备的大肠杆菌液体，阳性对照组加入2 mL大肠杆菌，阴性对照组加入2 mL沙棘提取液。放入恒温摇床中培养12~16 h，取出，观察细菌生长情况[23]。每管取100 μL涂布在固体培养基上，过夜培养，观察结果。常量肉汤稀释法见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.016.T001表1常量肉汤稀释法项目试管号12345678910稀释倍数1∶21∶221∶231∶241∶251∶261∶27空白阳性阴性肉汤/mL222222222—提取液/mL22222222—2菌液/mL2222222—22注：第8支试管不加菌液，作为空白对照；第9支试管不加提取液，作为阳性对照；第10支试管不加肉汤，作为阴性对照；“—”表示无添加。1.3数据统计与分析采用Excel 2021软件进行数据整理，SPSS 21.0进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以平均值和标准误表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1沙棘副产品营养成分分析由测定结果可知，沙棘副产品DM含量为97.98%，Ash含量为3.41%，CP含量为12.87%，EE含量为22.48%，NDF含量为41.63%，ADF含量为32.66%，Ca含量为3.24%，P含量为2.67%。2.2不同比例沙棘副产品体外产气特性（见表2和表3）由表2可知，随着沙棘副产品添加量的增加，各时间点产气量呈下降趋势，并且对照组显著高于Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.016.T002表2不同比例沙棘副产品体外产气量发酵时间对照组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组SEMP值3 h8.67a8.33a6.67b6.33bc5.67bc5.33c1.380.016 h15.33a15.00a8.33b8.00b7.67b7.00b3.690.019 h17.00a16.33a13.67b12.67bc12.00c11.67c2.190.0112 h22.67a21.00a18.67b18.33b16.67bc16.00c2.510.0124 h41.67a40.00a36.33b34.33c33.67c33.33c3.410.0136 h51.67a50.33a45.00b44.33bc43.33bc43.00c3.620.0148 h61.33a60.00a46.33b45.33bc44.00c43.33c7.830.01注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。mL由表3可知，随着沙棘副产品添加量的增加，瘤胃液快速产气量、慢速产气量、潜在产气量及产气速率呈下降趋势，并且对照组和Ⅰ组优于Ⅱ组、Ⅲ组、Ⅳ组、Ⅴ组。本研究中，沙棘副产品为枝、叶、籽，当沙棘副产品添加量为3%时，并未影响体外发酵。此外，沙棘副产品中的黄酮对发酵有一定的促进作用；而其他组各指标低于对照组的原因可能是沙棘副产品中枝叶及籽实增多，不易发酵，从而降低了发酵效率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.016.T003表3不同比例沙棘副产品体外产气参数项目对照组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组Ⅴ组SEMP值快速降解部分产气量（a）/mL1.0601.170-1.190-1.130-1.350-1.5900.040.58慢速降解部分产气量（b）/mL83.39085.94060.68060.87060.56060.6102.750.48潜在产气量（a+b）/mL84.45087.11059.49059.74059.21059.0203.030.55产气速率（c）/(%/h)0.0230.0240.0400.0300.0300.0300.000.092.3芦丁标准曲线的绘制结果（见图1）由图1可知，芦丁标准曲线y=0.332 4x+0.007 1。根据芦丁标准曲线可知，醇提法沙棘副产品活性提取物在540 nm下吸光值为1.27，样品测定量为2.1 mL，样品中黄酮含量为1.82 g/L；水提法沙棘副产品活性提取物在540 nm下吸光值为2.69，样品测定量为5.6 mL，样品中黄酮含量为1.45 g/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.016.F001图1芦丁标准曲线2.4醇提法对大肠杆菌抑菌效果的影响（见表4）由表4可知，滤纸片法和打孔法中无抑菌圈，常量肉汤稀释法抑菌效果最佳，稀释涂布中稀释倍数1∶23未出现大肠杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.016.T004表4醇提法对大肠杆菌抑制结果的影响项目大肠杆菌阳性对照阴性对照滤纸片法14.6 mm-+打孔法--+常量肉汤稀释法0.125 μL-+注：“＋”代表有抑菌效果，“-”代表没有抑菌效果；下表同。2.5水提法对大肠杆菌抑菌效果的影响（见表5）由表5可知，滤纸片法和打孔法无明显抑菌圈；常量肉汤稀释法抑菌效果最佳，稀释涂布中稀释倍数1∶22未出现大肠杆菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.03.016.T005表5水提法对大肠杆菌抑菌效果的影响菌种大肠杆菌阳性对照阴性对照滤纸片法--＋打孔法--+常量肉汤稀释法0.250 μL-+3讨论浆果类加工副产品可广泛应用于养殖，沙棘枝叶和果渣大部分在深加工过程中被作为不可食用的部分去除，造成了资源的浪费。研究发现，沙棘干叶中粗蛋白含量为12.86%~16.23%，粗脂肪含量为4.11%~6.25%，粗纤维含量5.22%~7.85%[24]。沙棘果渣中CP、EE含量分别为18.3%、11.6%[25]。本研究中，沙棘副产品为枝、叶、皮、籽实混合物，其中粗蛋白含量高于果渣，与沙棘叶相似，但粗脂肪含量（22.48%）远高于沙棘叶和果渣。研究表明，沙棘副产品相比单一的沙棘叶和沙棘果渣具有更高的营养价值，具有作为动物饲料的潜力。产气量是评价反刍动物瘤胃底物发酵程度的综合指标，在一定程度上反映了饲料在反刍动物瘤胃内的消化、降解特性。快速产气量为负值，说明饲料可能存在产气滞后效应[26]。本试验中，随着沙棘副产品添加量由5%逐渐增加至15%时，瘤胃的产气量及产气参数呈现递减的趋势；而添加量为3%时，与对照组无差别。造成产气量低的原因可能是沙棘副产品中枝条较多，其中NDF和ADF含量较高，造成产气量随添加量增加而减少。沙棘中含有大量酚类和黄酮类等活性物质。酚类化合物易溶于醇[27]。采用超声波法和浸渍-再循环法提取沙棘废料中多酚和黄酮类化合物，类黄酮类化合物含量为2.80~11.22 mg RE/g，占比为2.01%~16.84%，并且超声波法效果优于其他方法[28]。研究发现，采用醇提法提取不同沙棘果实中总黄酮含量为1.32~2.27 mg/g[29]，总黄酮含量占比为1.45%~4.35%[30]，沙棘叶中黄酮含量占比4%~6%[31-32]，果皮、果肉、籽实中黄酮含量分别为6.1、9.2及8.3 mg/g[33]。本研究中，采用醇提法得到的黄酮含量为1.82 g/L，提取效果优于水提法（1.45 g/L）。研究发现，乙醇体积为70%、提取3次、料液比1∶16，为沙棘叶黄酮最优提取方式，乙醇体积分数为50％、提取3次、料液比1∶24，为沙棘籽最优提取方式[33]。本试验中沙棘副产品为沙棘叶、沙棘籽、沙棘皮等混合物，采用醇提法，乙醇体积分数为60%，能够较好地提取对沙棘副产品中活性物质。未来可以通过改变乙醇浓度以及料液比等条件，进一步改善沙棘副产品的提取效果，以提高沙棘副产品的活性物提取量。本研究抑菌试验结果显示，醇提法比水提法抑菌效果更为明显，并且肉汤稀释法效果更好，进一步说明采用醇提法提取沙棘副产品活性提取物具有更好的效果，也说明沙棘副产品活性提取物的扩散速度和范围与其接触培养基的面积和高度有关。4结论沙棘副产品具有较高的营养价值，采用醇提法提取沙棘副产品中活性物质效果更优，沙棘副产品活性提取物对大肠杆菌具有一定的抑制作用。因此，沙棘副产品具有很大的开发利用价值。