随着微生物发酵工艺的不断发展，发酵中药在动物养殖中已取得了良好的应用效果[1-3]。六君子汤组方由党参、炒白术、陈皮、柴胡等中药组成，发酵工艺可增加六君子汤组方的有效成分，降低毒副作用，改善适口性。发酵六君子汤具有调节菌群平衡、抵御有害菌黏附及促进机体生长等优势[4]。现代药理研究显示，六君子汤具有提高肉鸡采食量、降低料重比、促进小肠对葡萄糖吸收等功效，常用于治疗功能性消化不良、胃炎等消化系统疾病[5-6]。但目前鲜有加味六君子汤及其发酵剂用于提高肉鸡生长性能、改善脾虚状态的报道。本试验选用发酵自拟方剂加味六君子汤，评价其对肉鸡生长性能、肠道酶活性、菌群数量和pH值的影响，为该制剂的临床应用和药理研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料自拟加味六君子汤发酵剂参照张桂枝等[7]发酵复方中药混菌发酵剂的步骤及方法制备，按照中兽医组方理论配伍，选用党参10份、炒白术10份、茯苓8份、陈皮6份、法半夏6份、柴胡5份、芍药5份、炙甘草3份，粉碎，过80目筛，调节含水量为40%，pH值为6.0，按照4%的比例加入枯草芽孢杆菌（2.7×104 CFU/g)，压实密闭于31 ℃培养72 h，烘干。1.2主要试剂及仪器主要试剂：鸡新城疫活疫苗（La Sota株）（广东永顺生物制药股份有限公司产品），脂肪酶、淀粉酶和蛋白酶活性等检测试剂盒（上海恒远生物科技有限公司产品）。主要仪器：PHSJ-5T酸度计（上海仪电科学仪器股份有限公司），OSR-MD高压蒸汽灭菌锅（广州市科洋医疗设备有限公司），WJ-80-Ⅱ CO2培养箱（上海超泓仪器设备有限公司），DHP-9082恒温培养箱（上海捷呈实验仪器有限公司），DNM-9606酶标仪（北京普朗新技术有限公司），BI280生化培养箱（上海皓庄仪器有限公司），XSP-13CA生物显微镜（上海光学仪器一厂），KH23A高速离心机（湖南凯达科学仪器有限公司）。1.3试验设计及饲养管理试验在山东畜牧兽医职业学院动物房进行，试验鸡舍设备均由河北巨康畜牧机械制造有限公司提供。选取1日龄健康、体重相近、雌性白羽肉鸡400只，随机分为4组，每组5个重复，每个重复20只肉鸡。A组、B组、C组分别在基础饲粮中添加0.6%发酵中药、1.2%发酵中药、1.2%未发酵中药，D组（对照组）饲喂基础饲粮。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.009.T001表1基础饲粮组成及营养水平项目1~20日龄21~36日龄原料组成/%玉米52.7859.83玉米干酒糟及其可溶物4.604.95豆粕26.7617.23棉籽粕3.854.05玉米蛋白粉4.405.05石粉1.551.38豆油3.114.75食盐0.270.27磷酸氢钙1.471.18DL-蛋氨酸0.290.21L-赖氨酸盐酸盐0.480.53氯化胆碱0.070.07L-苏氨酸0.070.18L-色氨酸0.130.12维生素预混料0.030.06微量元素预混料0.140.14合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)12.1412.95粗蛋白/%21.6619.08粗灰分/%5.915.08粗纤维/%3.162.78粗脂肪/%5.187.23总磷/%0.610.55有效磷/%0.400.35钙/%0.960.82总赖氨酸/%1.331.20注：1.维生素预混料为每千克饲粮提供：1~20日龄，VA 9 758 IU、VD3 3 756 IU、VE 19 IU、VK3 4.1 mg、VB1 2.3 mg、VB2 7.22 mg、VB6 4.86 mg、VB12 0.020 mg、烟酸 44.9 mg、叶酸1.28 mg、D-泛酸40.8 mg、生物素0.32 mg、胆碱349.2 mg；21~36日龄，VA 7 808 IU、VD3 2 996 IU、VE 12 IU、VK3 4.3 mg、VB1 2.1 mg、VB2 7.18 mg、VB6 4.1 mg、VB12 0.022 mg、烟酸43 mg、叶酸1.25 mg、D-泛酸 42 mg、生物素0.3 mg、胆碱350 mg。2.微量元素预混料为每千克饲粮提供：铜8.5 mg、铁54 mg、锌48.5 mg、锰70.2 mg、硒0.4 mg、碘0.56 mg。3.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。肉鸡采用平养饲喂模式，预试期7 d，正式试验期28 d。试验期间各组的采食、饮水等饲养管理条件相同。1.4测定指标及方法1.4.1样品采集肉鸡生长至20、36日龄时，每组随机选取10只肉鸡，解剖截取十二指肠、空肠、回肠、盲肠各段消化道，挤出食糜，并用灭菌生理盐水冲洗肠道，收集食糜及洗液，振荡5 min，灭菌纱布过滤，取上清液分装于EP管中，-20 ℃保存。1.4.2生长性能以重复为单位，分别在肉鸡8、20、36日龄进行称重，统计肉鸡8~20、21~36 d的采食量，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。ADG=(末重-初重)/(试验天数×肉鸡数量)(1)ADFI=总采食量/(试验天数×肉鸡数量)(2)F/G=ADFI/ADG(3)1.4.3肠道菌群数量在超净工作台取0.5 mL食糜上清液于灭菌试管，加入4.5 mL灭菌生理盐水，振荡5 min，取0.5 mL上清液于第二个试管中，按照上述步骤重复进行10倍稀释，稀释一定倍数后取100 μL涂布在麦康凯和LBS培养基上，置于培养箱中，37 ℃培养18~24 h后，采用形态学方法鉴定乳酸杆菌和大肠杆菌，采用平板计数法求出每克食糜所含的细菌数。1.4.4肠道酶活性及pH值取食糜上清液样品10倍稀释，混匀，3 600 r/min离心15 min，取上清液按试剂盒说明书测定消化道酶活性；将所取内容物用超纯水以1∶8稀释，采用酸度计测定pH值。1.5数据统计与分析试验采用SPSS 19.0统计软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1加味六君子汤发酵剂对肉鸡生长性能的影响（见表2）由表2可知，与D组相比，A组、B组肉鸡的ADG显著升高（P0.05），A组、B组、C组肉鸡的ADG分别提高了7.55%、7.64%、6.64%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.009.T002表2加味六君子汤发酵剂对肉鸡生长性能的影响项目8日龄体重/(g/只)20日龄体重/(g/只)36日龄体重/(g/只)ADFI/[g/(只·d)]ADG/[g/(只·d)]F/GP值0.8370.0350.0390.5320.0370.426A组220.53±10.68727.10±8.55ab2 257.93±10.51a125.15±4.9072.76±2.40a1.72±0.04B组221.10±10.81738.29±11.80a2 260.05±9.12ab125.25±5.9072.82±2.10a1.72±0.03C组223.92±9.68724.29±6.51b2 243.82±5.18b126.97±6.1072.14±2.70ab1.76±0.03D组221.78±9.59716.07±8.49b2 116.07±9.29b123.80±5.5067.65±2.70b1.83±0.04注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表4与此同。2.2加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道菌群数量的影响（见表3）由表3可知，与D组相比，A组和B组肉鸡回肠中乳酸杆菌数量显著升高（P0.05），A组肉鸡36日龄和B组肉鸡20日龄盲肠中乳酸杆菌数量显著升高（P0.05）；A组和B组肉鸡36日龄的回肠和盲肠大肠杆菌数量显著降低（P0.05），20日龄时A组肉鸡盲肠和B组肉鸡回肠大肠杆菌数量显著降低（P0.05）。与C组相比，36日龄时A组肉鸡回肠、盲肠中乳酸杆菌数量显著升高（P0.05）。各试验组均未检出沙门氏菌。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.009.T003表3加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道菌群数量的影响项目20日龄36日龄回肠盲肠回肠盲肠乳酸杆菌A组8.35±0.23a6.78±0.13ab7.80±0.26a8.58±0.22aB组8.36±0.25a7.23±0.23a7.38±0.21a8.27±0.16abC组7.73±0.14ab6.19±0.22ab6.30±0.12b7.96±0.21bD组7.58±0.23b6.02±0.16b6.05±0.16b7.82±0.27bP值0.0350.0410.0280.039大肠杆菌A组5.80±0.11ab5.31±0.16b5.11±0.19b5.84±0.12bB组5.36±0.14b5.71±0.15ab5.32±0.13b5.76±0.12bC组6.08±0.21ab6.10±0.22ab6.29±0.16ab6.43±0.14abD组6.24±0.27a6.36±0.13a6.53±0.16a6.76±0.16aP值0.0320.0220.0400.034沙门氏菌A组————B组————C组————D组————注：同一指标中，同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；“—”表示未检出。CFU/g2.3加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道酶活性的影响（见表4）由表4可知，与D组相比，A组、B组肉鸡肠道蛋白酶和淀粉酶活性显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.009.T004表4加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道酶活性的影响项目20日龄36日龄蛋白酶脂肪酶淀粉酶蛋白酶脂肪酶淀粉酶P值0.0360.0570.0290.0390.0610.032A组2 305.06±65.87a120.91±16.220.481±0.014a1 611.46±51.56a125.18±17.260.613±0.006aB组2 383.31±74.52a118.67±17.940.385±0.011b1 670.14±49.13a126.95±24.290.657±0.024aC组2 111.40±65.83ab114.25±11.810.400±0.007b1 219.35±52.02b113.17±17.940.435±0.005bD组1 970.00±60.41b93.58±11.710.302±0.008c1 219.00±52.02b103.60±14.740.435±0.005bU/g2.4加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道pH值的影响（见表5）由表5可知，与D组相比，20日龄时，B组肉鸡空肠、回肠、盲肠的pH值显著下降（P0.05）；36日龄时，A组和B组肉鸡空肠、回肠、盲肠的pH值显著下降（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.009.T005表5加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道pH值的影响项目十二指肠空肠回肠盲肠20日龄A组6.47±0.126.32±0.13ab6.47±0.08ab6.41±0.12abB组6.37±0.156.14±0.13b6.36±0.15b6.15±0.19bC组6.52±0.136.30±0.05ab6.56±0.12ab6.57±0.23abD组6.61±0.106.41±0.03a6.82±0.11a6.76±0.15aP值0.5360.0450.0260.03436日龄A组6.68±0.056.63±0.05b6.82±0.03b6.76±0.07bB组6.61±0.076.53±0.02b6.85±0.03b6.82±0.05bC组6.76±0.116.64±0.05ab6.86±0.08b6.80±0.12abD组6.87±0.096.73±0.16a7.05±0.14a7.02±0.14aP值0.6130.0390.0410.035注：同一日龄时，同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论肉鸡长期生活在高温高湿的环境中，会导致脾胃虚弱，从而引发肠道菌群、肠道消化酶和肠道pH值的异常，影响肉鸡的生长[8-9]。加味六君子汤具有补脾益气、行气化滞、燥湿化痰的功效，可用于治疗脾胃虚弱型消化不良、十二指肠炎症、肠道菌群失调等多种疾病[9-11]。研究发现，发酵中药方剂可以提高动物的生长性能，促进消化酶的分泌，改善肠道菌群及肠道pH值等指标[12-14]。3.1加味六君子汤发酵剂对肉鸡生长性能的影响肉鸡饲粮中添加健脾、行气、化痰类中药及其发酵物可以提高肉鸡的生长性能[13-15]。张桂枝等[7]研究发现，饲粮中添加1.0%的六君子散剂有提高肉鸡日增重的趋势。乔宏兴等[16]研究表明，饲粮中添加发酵黄芪可以明显提高肉鸡的采食量和平均日增重，改善料重比。杨珍珍[17]研究发现，中药配方中的白术提取物对肉鸡生长性能、血清生化指标及肠道形态结构等指标有显著的改善作用，可以抑制肉鸡肠道有害微生物增殖，增强肉鸡的免疫力，提高营养物质的消化和吸收率，从而改善生长性能。本研究结果表明，饲粮中添加0.6%、1.2%的自拟加味六君子汤发酵剂可以提高肉鸡的平均日增重，与上述研究结果一致。3.2加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道菌群数量的影响肠道是机体消化和吸收营养物质的重要部位，乳酸杆菌和大肠杆菌数量是影响肠道环境的重要因素，与机体的消化能力及健康状态有明显的相关性[18-20]。党参、白术、白芍、黄芪等健脾类中药提取物能够明显增加畜禽肠道中乳酸杆菌的数量，降低肠道内大肠杆菌的数量，抑制有害菌的生长，微生态制剂和益生菌均能够促进肉鸡肠道中有益菌的繁殖，改善肉鸡肠道环境[21-23]。曾益等[24]研究发酵中药制剂对肉鸡肠道菌群的影响，结果显示，发酵中药制剂组乳酸杆菌含量比对照组和抗生素组分别显著提高了40.66%、24.27%。本试验中，与对照组相比，加味六君子汤发酵剂能够显著提高白羽肉鸡回肠和盲肠乳酸杆菌数量，显著降低大肠杆菌数量，与上述研究结果一致。这主要是由于加味六君子汤发酵剂具有健脾益气、燥湿化痰的功效，科学的发酵工艺可以增加中药中有益菌数量，从而调整肉鸡肠道菌群。3.3加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道酶活性的影响肠道消化酶参与机体很多重要的生化反应，对于吸收消化营养物质和生长发育具有重要作用。陈皮、白术、茯苓、甘草等健脾类中药提取物能够显著提高肉鸡肠道淀粉酶、蛋白酶的活性[25-27]。杨瑞思等[28]研究表明，在肉鸡饲粮中添加复合噬菌体裂解酶，其培养物能够显著提高小肠中淀粉酶的活性，添加单株嗜酸性乳酸杆菌能够提高肠道内蛋白酶的活性。王丹等[29]研究微生物发酵饲料在肉鸡生产中的应用，结果发现，乳酸杆菌发酵制剂可以使肉鸡淀粉酶活性提高40.89%，而蛋白水解酶和脂肪酶活性差异不显著。本试验中，加味六君子汤发酵剂可以提高肉鸡肠道淀粉酶和蛋白酶活性，说明发酵工艺可以提高加味六君子汤促进肉鸡肠道消化酶分泌的作用，从而提高肠道酶活性。3.4加味六君子汤发酵剂对肉鸡肠道pH值的影响肠道pH值是判断黏膜血含量和氧含量是否充足的重要指标，对维持消化道菌群动态平衡和各类消化酶生物催化具有重要作用。关于稳定畜禽肠道pH值的研究和应用，益生菌及酸化剂的报道较多，而中药及发酵产品对畜禽肠道pH值的影响研究较少[30-32]。闻爱友等[33]在肉鸡饲粮中添加植物提取物，研究其对肠道pH值的影响，结果显示，随着植物提取物添加剂量的增加，pH值由6.50逐渐降低至6.13。本试验中，在肉鸡饲粮中添加加味六君子汤发酵剂使肉鸡肠道pH值显著下降。原因是发酵后的加味六君子汤增加了肠道内有益微生物菌群数量，促进了肠道酶的分泌，从而酸化肠道环境，调节肠道pH值，进一步活化肠道有益菌，共同发挥加味六君子汤药方调节胃肠运动、修复损伤黏膜、调节胃肠内分泌功能等作用。4结论在本试验条件下，肉鸡饲粮中添加0.6%加味六君子汤发酵剂可以提高肉鸡的平均日增重，增强肠道淀粉酶和蛋白酶活性，增加肠道中乳酸杆菌数量，降低肉鸡肠道大肠杆菌数量。