在严格厌氧的青贮环境中，大多数微生物的活动会受限制[1]。酵母菌会参与青贮饲料有氧暴露过程中的好气性变质过程，被认为是青贮饲料发酵及有氧暴露过程中的有害微生物[2-3]。参与青贮饲料有氧变质的酵母菌可归纳为两类：一类为有机酸利用酵母（acid-utilizers），一类为发酵糖类酵母（suger-utilizers）[4]。青贮开装后的有氧变质程度主要由能利用有机酸酵母菌数决定[5]。唐振华等[6]研究发现，玉米青贮饲料中的酵母菌以假丝酵母（Candida）和毕赤酵母（Pichia）为主，假丝酵母包括光滑假丝酵母（C. glabrata）、桔假丝酵母（C. quercitrusa）和中间假丝酵母（C. intermedia），毕赤酵母包括发酵毕赤酵母（P. fermentans）和库德里阿兹威(氏)毕赤酵母（P. kudYlaVZevii）等。李宝明等[7]研究发现，多花黑麦草（Lolium multiflorum）青贮饲料中的酵母菌主要有异常毕赤酵母（P. anomala）、伯顿毕赤酵母（P. burtonii）、毕赤克鲁维酵母（P. kudriavzevii）、库德里阿兹威(氏)毕赤酵母（P. kudrlaVZeVii）和酿酒酵母（S. cerevisiae）等。进一步研究探讨分离得到酵母菌的生长特性，探明酵母菌的有机酸利用特性及生长和耐受性对减少青贮开装后的营养损失具有重要意义。本研究对苏丹草青贮饲料有氧暴露过程中分离得到的酵母菌进行生长和耐受性试验，查明其对乳酸和乙酸的利用特性，结合有氧稳定性试验，探讨酵母菌与苏丹草青贮饲料有氧变质之间的关系，以期为减少苏丹草青贮饲料开装后的营养损失提供参考。1材料与方法1.1原料与加工调制苏丹草种植于新疆农业大学三坪农场校内实习基地（新疆乌鲁木齐，43°54´ N，87°19´ E）。以抽穗期刈割的新苏3号苏丹草（新疆瑞吉兰德牧草种业有限公司提供）为青贮原料。刈割后，将苏丹草原料晾晒在水泥晾晒场中，其下铺一层干净的塑料薄膜，每2 h轻翻1次，晾晒8 h，晾晒后切短至1~2 cm待贮。苏丹草原料青贮特性：凋萎8 h后的苏丹草，其干物质含量为296 g/kg FM，粗蛋白含量为108 g/kg DM，可溶性糖含量为123 g/kg DM，中性洗涤纤维为661 g/kg DM，酸性洗涤纤维为315 g/kg DM，粗脂肪含量为31.4 g/kg DM，粗灰分含量为58.4 g/kg DM，缓冲能值为169 mEq/kg DM，pH值为5.05，附着的乳酸菌数量为3.53 lgCFU/g FM。1.2试验方法1.2.1青贮试验分别用下列乳酸菌处理：植物乳杆菌（L. plantarum）（LP组，添加量为1×106 CFU/g）、鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）（LR组，添加量为1×106 CFU/g）、布氏乳杆菌（L. buchneri）（LB组，添加量为1×106 CFU/g），以上乳酸菌添加剂均由中国农业大学草业科学与技术学院提供。对照处理（CK组）不添加任何菌剂。利用小型喷壶将菌液（已提前按比例配置好）均匀喷洒至晾晒8 h后的苏丹草原料上，以5 L聚乙烯塑料桶作为青贮容器。CK组喷洒等量的蒸馏水。每个处理重复9次，确保每桶青贮饲料的密度一致（3 200±100）g，将苏丹草在室温环境（22~35 ℃）下发酵60 d。参考Zhang等[8]的方法进行有氧稳定性的测定（联测_SIN-R8000D，杭州联测自动化技术有限公司）。当样品温度超过环境温度2 ℃时停止进行记录。有氧变质后测定酵母菌的种类变化。1.2.2有机酸利用特性和生长耐受性试验乳酸利用特性（pH值4.0）以5 g/L乳酸代替YPD液体培养基中的葡萄糖。乙酸利用特性以5 g/L乙酸代替YPD液体培养基中的葡萄糖。接种后25 ℃培养3周，根据液体培养基pH值上升情况，判断酵母菌利用有机酸能力的高低。pH值生长试验：分别将YPD培养基pH值调整到3.0、3.5和4.0，接种后25 ℃培养1周观察液体培养基的浑浊度。温度生长试验（pH值4.0）：接种后分别在40 ℃和45 ℃水浴条件下培养2 d，观察液体培养基的浑浊度。有机酸耐受试验：乳酸，YPD液体培养基（含35 g/L乳酸，pH值4.0）；乙酸，YPD液体培养基（含8 g/L乙酸，pH值4.0）；乳酸和乙酸，YPD液体培养基（含35 g/L乳酸和8 g/L乙酸，pH值4.0）。接种后，25 ℃培养3周观察液体培养基的浑浊度。1.3指标测定及方法参考Zhang等[8]方法进行新鲜牧草及青贮饲料的干燥和过筛等工作，同时测定干物质、粗蛋白质、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维、粗脂肪、粗灰分、可溶性糖、乳酸、乙酸、丙酸、丁酸含量、氨态氮含量和缓冲能值、pH值。参考王慧丽[9]方法对苏丹草青贮饲料中酵母菌进行分离、纯化、保存、鉴定和计数，同时对分离的酵母菌进行有机酸利用特性和生长耐受性试验鉴定。酵母菌有机酸利用和生长耐受性试验中所用的YPD液体培养基的配方为：10 g酵母浸粉、10 g蛋白胨、900 mL水，121 ℃灭菌20 min、100 mL无菌滤膜过滤除菌后的20%（w/v）葡萄糖溶液。采用平板计数法进行苏丹草及苏丹草青贮饲料中乳酸菌数量的测定[8]。V-score评分方法参考日本粗饲料评定手册（2001）[10]。1.4数据统计与分析在NCBI上进行酵母菌序列的比对分析，采用MEGA 7.0进行酵母菌种群系统进化树的构建，采用SigmaPlot 14.0进行相关图表的绘制，利用SPSS 21.0软件进行方差分析。2结果与分析2.1乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响（见表1）由表1可知，与对照相比，乳酸菌的添加可显著提高苏丹草青贮饲料的发酵品质；乳酸菌处理后显著（P0.05）降低苏丹草青贮饲料的pH值和丁酸、氨态氮、酵母菌含量，同时显著（P0.05）增加苏丹草青贮饲料中的乳酸、乳酸菌含量和V-score。LP组评分最高，青贮品质最好。V-score从高到低依次为LP组LR组LB组CK组，LP组V-score达到92。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.019.T001表 1乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响项目CK组LP组LR组LB组SEMP值pH值4.56a4.11c4.32b4.28b0.050.001乳酸/（g/kg） DM25.8d49.4a46.8b39.8c2.78＜0.001乙酸/（g/kg） DM11.5b5.37c7.86c15.7a1.23＜0.001乳酸/乙酸2.25c9.22a5.97b2.59c0.86＜0.001丙酸/（g/kg） DM1.43a0.94b1.21a1.33a0.060.004丁酸/（g/kg） DM4.85a0.39c1.35b1.41b0.51＜0.001氨态氮/（g/kg） TN124a56.8bc63.0b54.2c8.73＜0.001乳酸菌/（lgCFU/g） FM4.40d6.61a5.72b5.14c0.25＜0.001酵母菌/（lgCFU/g） FM4.04a3.35b2.44c2.05d0.24＜0.001V-score32d92a81b78c7＜0.001注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）;下表同。2.2乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧稳定性的影响（见表2）由表2可知，与对照相比，乳酸菌的添加显著（P0.05）提高苏丹草青贮饲料的有氧稳定时间。有氧稳定时间从高到低依次为LB组LR组LP组CK组，LB组处理下的有氧稳定时间最长，达到157 h，显著（P0.05）高于其他3个处理。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.019.T002表2乳酸菌对苏丹草青贮饲料的有氧稳定性的影响单位：h项目CK组LP组LR组LB组有氧稳定时间54d85c116b157a2.3苏丹草青贮饲料中分离鉴定的酵母菌26S rDNA D1/D2区序列系统进化树（见图1）从苏丹草青贮饲料中共分离得到151株酵母菌。分离和纯化酵母菌，使用单链构象多态性分析对其进行初步筛选，之后进行26S rDNA的D1/D2区序列测定，将酵母菌鉴定到种水平。通过Mega 7.0构建系统发育树。测定得到的序列与对应模式菌株序列的相似度，得到的序列与模式菌株的26S rDNA序列构建的系统发育树。由图1可知，所有分离得到的酵母菌菌株与GenBank上检索得到的模式菌株均处于同一分支。因此，分离得到9种酵母菌与对应的模式菌株均属于同一种。其中，Knuc为核苷酸替代值；节点数值为重复检验1 000次分配所得的靴值；括号内为基因收录号。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.019.F001图1苏丹草青贮饲料中分离鉴定的酵母菌26S rDNA D1/D2区序列系统进化树2.4酵母菌的有机酸利用特性和生长耐受性（见表3）由表3可知，发酵结束时，只有CK、LP组中检测到拜氏接合酵母（Z. bailii）；至各处理有氧变质时（青贮饲料温度大于环境温度2 ℃时）拜氏接合酵母（Z. bailii）所占比例最大，其中最大的为CK组处理，其比例达到60.9%。有氧稳定时间最长的LB组处理，有氧变质时的酵母菌种类最少，仅有4种，分别是拜氏接合酵母（Z. bailii）、热带假丝酵母（Candida tropicalis）、嗜酒假丝酵母（Candida ethanolica）和假丝酵母（Candida rugosa）。在苏丹草青贮饲料中检出的酵母菌，除克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）之外，其余均能利用乳酸和乙酸。苏丹草青贮饲料中分离出的9种酵母菌在pH值3.0~4.0的环境条件下均能正常生长。40 ℃的条件下，仅有嗜酒假丝酵母（C. ethanolica）和桔假丝酵母（Candida quercitrusa）不能正常生长；45 ℃条件下时，除嗜酒假丝酵母（C. ethanolica）和桔假丝酵母（C. quercitrusa）不能正常生长之外，热带假丝酵母（C. tropicalis），假丝酵母（C. rugosa）和酿酒酵母（S. cerevisiae）也不能正常生长，光滑假丝酵母（Candida glabrata）在45℃的环境条件下表现为微弱生长。分离出的所有酵母菌均能在YPD液体培养基中正常生长（乳酸含量35 g/L），而在乙酸含量为8 g/L的液体培养基中，热带假丝酵母（C. tropicalis）、桔假丝酵母（C. quercitrusa）和克鲁维酵母（K. marxianus）受到抑制；在乳酸和乙酸的共同作用下，除热带假丝酵母（C. tropicalis），桔假丝酵母（C. quercitrusa）和克鲁维酵母（K. marxianus）受到抑制外，毕赤克鲁维酵母（P. kudriavzevii）也受到抑制，不能正常的生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.019.T003表3酵母菌的有机酸利用特性和生长耐受性项目拜氏接合酵母热带假丝酵母嗜酒假丝酵母假丝酵母光滑假丝酵母桔假丝酵母克鲁维酵母酿酒酵母毕赤克鲁维酵母分离的酵母菌比例/%CK组21.418.730.3ndndndnd29.6ndS-CK60.914.82.920.3ndndnd0.30.8LP组16.8ndndndnd83.2ndndndS-LP51.711.312.420.9nd1.50.90.80.5LR组ndndndndndndndndndS-LR46.7nd8.326.45.22.78.91.8ndLB组ndndndndndndndndndS-LB37.225.918.618.3ndndndndnd有机酸利用特性a乳酸+++++++++乙酸++++++--+pH值生长试验b3.0+++++++++3.5+++++++++4.0+++++++++温度生长试验c40 ℃++-++-+++45 ℃+---w-+-+有机酸耐受试验d乳酸+++++++++乙酸+-+++--++乳酸+乙酸+-+++--+-注：a中+表示阳性（pH＞4.20），-表示阴性（pH＜4.05）；b,c,d中+表示正常生长，w表示生长较弱，-表示不生长；S-CK为有氧变质后的对照处理组，S-LP为有氧变质后的植物乳杆菌处理组，S-LR为有氧变质后的鼠李糖乳杆菌处理组，S-LB为有氧变质后的布氏乳杆菌处理组。3讨论3.1乳酸菌对苏丹草青贮饲料发酵品质的影响有研究表明，添加植物乳杆菌（L. plantarum）和布氏乳杆菌（L. buchneri）可显著提高青贮饲料的发酵品质[11]。Gulfam等[12]在30℃的环境条件下，以象草为青贮原料，探讨鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）对象草发酵品质的影响，发现接种鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）后象草中乳酸含量显著增加。而Guan等[13]在四川地区开展的对全株玉米青贮的研究却发现，鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）对青贮发酵产物和微生物群落的影响很小。本研究中，使用鼠李糖乳杆菌（L. rhamnosus）提高苏丹草青贮饲料的发酵品质（表现为增加苏丹草青贮饲料的乳酸含量，同时降低其pH值、丁酸和氨态氮含量），这与Gulfam等[12]的结果一致。3.2乳酸菌对苏丹草青贮饲料有氧稳定性的影响乳酸菌在青贮发酵过程中的主要产物为乳酸，但异质型乳酸菌（主要是布什乳杆菌L. buchneri）在青贮发酵过程中还会产生一定的乙酸[14-15]。青贮原料的特性、是否使用添加剂以及添加剂的类型等这些因素都会影响到青贮饲料的有氧稳定性[16]。Filya[17]以青贮玉米为研究对象，以布氏乳杆菌（L. buchneri）和植物乳杆菌（L. plantarum）为外源添加剂添加到青贮玉米中，发现相较于植物乳杆菌（L. plantarum）处理（有氧稳定时间仅为26~31 h），布氏乳杆菌（L. buchneri）处理（有氧稳定时间80~181 h）可显著提高青贮玉米的有氧稳定性。布氏乳杆菌（L.buchneri）可产生一定量的乙酸。饲料中的真菌主要受到非解离的短链脂肪酸的抑制作用。相较于乳酸菌生长繁殖过程中的主要代谢产物乳酸，乙酸不易解离，因而其对真菌的抑制作用强于乳酸，这可能是添加布氏乳杆菌（L. buchneri）后其有氧稳定性强于植物乳杆菌（L. plantarum）的原因[18]。3.3酵母菌的有机酸利用特性和生长耐受性酵母菌（如假丝酵母属Candida和毕赤酵母属Pichia等）可能在青贮饲料发生有氧变质的过程中起主要作用[19]。酵母菌比较耐酸，且大多可以利用乳酸，会使得青贮饲料中的pH值升高，进而引起其他不良微生物的大量生长[20]。本研究分离的酵母菌均可利用乳酸，且均能在pH值3.0~4.0的环境条件下生长，当氧气进入青贮饲料中时，会重新激活这些酵母菌，进而引起青贮饲料的有氧变质。王慧丽[9]以全株玉米及其调制的TMR原料为研究对象，在TMR好氧变质过程中只检出了拜氏接合酵母（Z. bailii），推测拜氏接合酵母（Z. bailii）可能是引起TMR好氧变质的主要原因。本研究在各组有氧变质的苏丹草青贮饲料中均检出拜氏接合酵母（Z. bailii），且比例最高，推测拜氏接合酵母（Z. bailii）可能是引起苏丹草青贮饲料有氧变质的主要酵母菌，但该研究结果仍需更多的试验予以验证。4结论乳酸菌的添加显著提高苏丹草青贮饲料的发酵品质，LP组V-score评分最高。添加布氏乳杆菌（L. buchneri）对提高苏丹草青贮饲料有氧稳定性的效果最好，其有氧稳定时间达到了157 h。拜氏接合酵母（Z. bailii）可能是引起苏丹草青贮饲料有氧变质的主要酵母菌。