饲料的加工过程涉及物理变化、化学变化以及生物发酵。转基因产品的外源基因在加工时会随着产品自身基因组DNA的降解发生降解[1-3]。不同原料经过加工后其DNA降解变化情况差异很大，不同外源基因在受到同样处理时其破坏程度也不同[4]。目前，大豆、水稻在食品加工过程中内外源基因的降解情况已有研究[5-8]。本试验针对玉米蛋白粉实际加工流程，通过数字PCR技术探索转基因玉米蛋白粉加工过程中内、外源基因的降解变化规律，为我国玉米饲料产品的转基因生物安全评价和终端检测提供技术支持，为相关产品的标识制度提供参考。1材料与方法1.1玉米蛋白粉工艺流程玉米蛋白粉工艺流程图见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.022.F001图1玉米蛋白粉工艺流程图原料玉米经亚硫酸浸泡后进行破碎、胚芽分离、精磨处理，得到精浆液。精浆液经过分离、浓缩离心、干燥得到玉米蛋白。试验中，试样1为原料玉米；试样2为酸浸玉米；试样3为精浆液；试样4为玉米蛋白浆液。1.2试剂耗材十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）购自Sigma-Aldrich公司；十二烷基硫酸钠（SDS）购自Sigma-Aldrich公司；三氯甲烷、异戊醇、异丙醇、乙醇等试剂均为分析纯或生化级试剂均购自国药集团化学试剂有限公司；试验用水均为超纯水。Biorad QX200微滴式数字PCR系统配套试剂及耗材包括2×dd PCR反应预混夜、微滴发生油、微滴分析油、微滴发生板（8孔）、胶条、铝覆膜、PCR反应板（管）等。引物及探针合成、标记均在Takara公司进行。内源基因选择编码玉米淀粉合酶异构体zSSII-2的基因zSSIIb（GenBank No. AF019297.1），外源基因选择苏云金杆菌（Bacillus thuringiensis）杀虫结晶蛋白基因Cry1A(b)（GenBank No. AY326434.1）作为靶标序列设计大致相同区域但不同扩增片段引物探针，PCR引物及探针序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.022.T001表1PCR引物及探针序列目标基因引物、探针序列扩增片段大小/bpzSSIIb-1F:5'-CGGTGGATGCTAAGGCTGATG-3'88R:5'-AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC-3'P:5'-FAM-TAAGGAGCACTCGCCGCCGCATCTG-TAMRA-3'zSSIIb-2F:5'-CCAATCCTTTGACATCTGCTCC-3'114R:5'-GATCAGCTTTGGGTCCGGA-3'P:5'-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCTGCAATGCA-TAMRA-3'zSSIIb-3F:5'-CTCCCAATCCTTTGACATCTGC-3'151R:5'-TCGATTTCTCTCTTGGTGACAGG-3'P:5'-FAM-AGCAAAGTCAGAGCGCRGCAATGCA-TAMRA-3'zSSIIb-4F:5'-CCTCAGCTGGGACCACG-3'232R:5'-CCAAATTCCCAGGGCACG-3'P:5'- FAM-CGCCGCTCCTGTCGCAGGACCTGGA-TAMRA-3'Cry1A(b)-1F:5'-CGCGACTGGATCAGGTACA-3'75R:5'-TGGGGAACAGGCTCACGAT-3'P:5'- FAM-CCGCCGCGAGCTGACCCTGACCGTG-TAMRA-3'Cry1A(b)-2F:5'-GGTGGCTCCTACAAATGCC-3'105R:5'-GATGCTCCTCGTGGGTGG-3'P:5'- FAM-TGCCTCTGCCGACAGTGGTCCCAAAGA-TAMRA-3'Cry1A(b)-3F:5'-CTCTGCCGACAGTGGTCC-3'161R:5'-AGGAAGGGTCTTGCGAAGG-3'P:5'- FAM-CCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGG- TAMRA -3'Cry1A(b)-4F:5'-CCGACAGTGGTCCCAAAGA-3'197R:5'-TCAGCGTGTCCTCTCCAA-3'P:5'- FAM-CCCCCACCCACGAGGAGCATCGTGG-TAMRA-3'1.3试验仪器超微量蛋白核酸分析仪（Denovix DS-11+）购自美国丹诺尔公司；冻干机（FreeZone®2.5L）购自美国Labconco公司；微滴式数字PCR系统（QX200™）（包括微滴生成器、封膜机、PCR扩增仪和微滴读取仪）购自美国Bio-Rad公司。1.4试验方法1.4.1样品中DNA提取样品前处理：试样1采用双蒸水清洗3遍，超净台吹干，液氮下研钵粉碎待用；试样2超净台吹干，双蒸水清洗3遍，浸泡6 h，再次吹干，液氮下研钵粉碎待用；试样3冻干过夜，液氮下研钵粉碎待用；试样4冻干过夜，液氮下研钵粉碎待用。改良SDS-CTAB提取法：（1）称取1 g样品干粉，置于50 mL离心管中，加入6 mL的SDS裂解液（2.5% SDS、0.5% PVP、1 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、50 mmol/L EDTA（pH值8.0）、10 mmol/L β-巯基乙醇），充分振荡混匀。（2）置于电热恒温水槽中65 ℃温育90 min，每隔5~10 min混匀1次。（3）加入3 mL 5 mol/L KAC（pH值6.0），置于0 ℃冰浴20 min。（4）加入2 mL CTAB裂解液（2% CTAB、1.4 mol/L NaCl、100 mmol/L Tris-HCl（pH值8.0）、20 mmol/L EDTA（pH值8.0）），混匀，65 ℃水浴30 min。（5）加入6mL 25∶24∶1的苯酚∶氯仿∶异戊醇溶液，置摇床上充分混匀后静置10 min。（6）13 000×g离心20 min后，取全部上清液至新的50 mL离心管中。（7）重复抽提2次，转移至新的10 mL离心管中。（8）加入1/3体积预冷的异丙醇，混匀后-20 ℃放置4 h。（9）25 ℃，13 000×g离心20 min，弃上清，转移至新的2 mL离心管中，1.5 mL无水乙醇洗涤沉淀2次，每次10 min，通风柜风干沉淀1 h。（10）加100 µL双蒸水，37 ℃水浴30 min溶解DNA后置4 ℃冰箱备用。1.4.2DNA质量检测取2 µL提取的DNA采用超微量蛋白核酸分析仪测定浓度、A260 nm/A280 nm和A260 nm/A230 nm，以评估提取DNA质量。1.4.3微滴数字PCR反应体系及条件参考文献[9-11]方法，微滴数字PCR设置上、下游引物各1 µL（500 nmol/L），探针0.5 µL（250 nmol/L），ddPCR Super mix for Probes 10 µL，DNA模板5 µL（各样品浓度均稀释至20 mg/L），加ddH2O至20 µL。利用Bio-Rad QX100 数字PCR微滴生成仪将20 µL体系混合物合成微滴，再利用Bio-Rad T100 PCR仪进行扩增。ddPCR反应条件为：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性30 s，50~60 ℃退火1 min，40个循环，98 ℃微滴固化10 min，4 ℃保存。PCR反应结束后，利用Bio-Rad QX200 微滴分析仪读取DNA拷贝数。1.4.4DNA降解模型分析研究参考Deagle等[12]建立的DNA降解模型来探究不同加工处理后的转基因玉米中内、外基因的降解情况：DNA损伤导致的链断裂或化学修饰会影响PCR的扩增，这个过程是由许多机制引起的。该模型建立的基础是降解的样品发生DNA损伤符合泊松分布，且每一个核苷酸被损坏的概率都基本相等，为参数λ。未损坏碎片大小（x）即DNA降解后的片段大小的结果分布由指数函数定义：f(x)=λe-λx (1)由指数函数的性质可知，平均未损坏碎片大小为1/λ，未损坏碎片大小的方差为1/λ2。PCR可以扩增未被损坏的DNA，当PCR扩增的目的条带大小为x，根据公式（1），扩增后能得到拷贝数是e-λx，如果样本中存在的DNA拷贝总数为N，则用AX表示的预期可扩增拷贝数为Ne-λx。使用对数变换，这种关系可以线性形式表示为：log(Ax)=log(N)–λx(2)由于降解过程的随机性，Ax的值会发生变化，如果这个过程符合泊松分布，则可以计算出方差的大小：S=Ne-λx(1-e-λx)(3)1.5数据统计与分析采用SPSS软件进行数据分析，结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1玉米饲料加工不同阶段DNA浓度和纯度（见表2）由表2可知，4个阶段的样品提取得到的DNA的A260 nm/A280 nm比值均在1.7~1.9之间，可以看出该方法得到的玉米基因组DNA纯度接近，试样3和试样4由于样本自身原因，存在微量的蛋白质污染。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.022.T002表2玉米饲料加工不同阶段DNA浓度和纯度项目试样1（原料玉米）试样2（酸浸玉米）试样3（精浆液）试样4（玉米蛋白浆液）DNA浓度/（mg/L）1 099.0±37.3913.0±27.8281.0±12.1122.0±11.6A260 nm/A280 nm1.86±0.021.83±0.031.77±0.051.72±0.06A260 nm/A230 nm1.99±0.032.01±0.031.62±0.061.61±0.082.2数字PCR检测及DNA降解分析根据1.4.4Bruce数学模型，针对玉米蛋白饲料不同加工阶段样品的内源zSSIIb和外源Cry1A(b)基因，利用数字PCR计算经过饲料加工处理后的不同片段大小的DNA初始拷贝数，同时评估每一个片段核苷酸被损坏的概率λ。不同阶段处理对zSSIIb和Cry1A(b)基因的影响见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.022.F002图2不同阶段处理对zSSIIb和Cry1A(b)基因的影响由图2可知，从处理阶段分析，试样1与试样2得到的阳性微滴数无显著变化，试样3阳性微滴数显著下降，试样4阳性微滴数进一步下降；从片段大小角度分析，数字PCR扩增的片段较小时，得到的阳性微滴数最多，而片段偏大时，数字PCR得到的阳性微滴数最少。这种递减趋势在试样3和试样4的样品中更加明显。研究计算4个试样中不同扩增片段条件下，DNA被破坏的概率λ的数值和在不同加工阶段试样DNA能维持在最大的片段长度1/λ的数值，不同PCR扩增中模板的拷贝数和基因的降解结果见表3。由表3可知，试样2与试样1相比，DNA几乎没有受到影响，不同片段的扩增效率无显著差异，但是对比试样3和试样4可以发现，内源zSSIIb和外源Cry1A(b)基因扩增的DNA数量与PCR产物的大小称负相关。如：内源zSSIIb，试样3中，片段、88 bp扩增的数量是片段232 bp的19.3倍，且R2值接近1；在试样4中，片段232 bp更是没有检测到拷贝数，外源Cry1A(b)基因与内源zSSIIb降解趋势一致。但从λ值来看，Cry1A(b)基因降解概率更大。相对于试样1，试样2的DNA降解可以忽略，故此两个基因R2值都非常低，表明该模型并不适用DNA轻微降解的样品中，但对于试样3和试样4高度降解的DNA样品具有很好的适用性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.022.T003表3不同PCR扩增中模板的拷贝数和基因的降解结果zSSIIb88 bp114 bp151 bp232 bpλ1/λR2原料玉米3 8563 9783 5613 5310.0031 890.00.18酸浸玉米3 1784 2523 3593 0010.0071 599.00.21精浆液673435112350.025121.30.91玉米蛋白浆液2302292300.03179.00.98Cry1A(b)75 bp105 bp161 bp197 bpλ1/λR2原料玉米2 1192 2342 1432 4560.0051 231.00.23酸浸玉米2 0072 3212 2212 1240.0051 319.00.22精浆液3392716100.037291.10.95玉米蛋白浆液66601200.04559.00.993讨论原料玉米酸浸时，酸性pH值条件会破坏DNA的磷酸键，从而造成DNA的降解[13-14]。但是，本研究表明，酸浸时转基因玉米内、外源基因几乎不受影响，原因是在浸泡过程中，产品均以完整籽粒的形式存在，DNA受到细胞壁的保护而不被分解，所以pH值对DNA的影响十分有限。玉米的破碎分粗磨和精磨两步。精磨前，一部分物料仍是颗粒物料的状态；精磨后，细胞壁破坏完全，纤维、蛋白以及淀粉被大量释放，从纤维及蛋白质网中提取出大量的淀粉。虽然机械损伤对DNA破坏有限，但浸泡、湿磨等加工过程能使玉米基因和质粒DNA大量降解，精磨后精浆液中内、外源基因遭到显著破坏。玉米蛋白浆液阶段又加大DNA暴露时间，内、外源基因不断被破坏。为科学计算加工过程中样品DNA降解概率引入Bruce数学模型，该模型高度适配精磨后精浆液和玉米蛋白浆液阶段高度降解的DNA样品，而且从λ值来看，外源基因Cry1A(b)在这两个阶段降解概率要大于内源基因zSSIIb。酸浸过程对于转基因玉米DNA破坏极为有限，故该模型不适用于该阶段样品。4结论饲料加工的复杂性决定每一道工序都给样品DNA降解和破坏提供独特的环境。酸浸对样品DNA的降解影响有限，但浸泡后的浆料湿磨以及蛋白分离阶段样品DNA降解严重。数学模型计算DNA损坏概率表明，内源zSSIIb和外源Cry1A(b)基因扩增的DNA数量与PCR产物的大小呈负相关，同时，Cry1A(b)基因降解概率更大。