黄花苜蓿（Medicago falcata L.）是苜蓿属（Medicago L.）的草本植物，具有广泛适应性、耐寒、多叶、耐牧等优质特性[1-3]。随着生物技术的发展，具有快捷、高效等优点的分子标记技术逐渐被应用于相关遗传研究中[4]，如进行籼稻的遗传多样性研究[5]、开发小麦的16K SNP芯片并进行QTL鉴定和对高筋品种的遗传分析[6-7]、开发武夷茶树的SNP分子标记[8]。在分子标记技术中，简化基因组测序技术（specific-locus amplified fragment sequencing，SLAF-seq）[9]可以快速鉴定出高密度的SNP位点，在此基础上可进行遗传进化分析，简化基因组测序技术在遗传多样性的有关研究中扮演着较为重要的角色[10]。紫花苜蓿（Medicago sativa L.）素来有“牧草之王”的美誉。随着畜牧业的不断发展，我国对苜蓿的利用水平逐渐提高，对苜蓿的营养品质要求也不断提高。黄花苜蓿与紫花苜蓿可自然杂交，可以育成更加耐牧、品质更高的紫花苜蓿品种，因此对黄花苜蓿的深入研究对我国畜牧业的发展具有重要意义。本研究旨在揭示新疆野生黄花苜蓿的遗传多样性，从而更好地指导高产苜蓿品种的育种工作。1材料与方法1.1试验材料黄花苜蓿材料由新疆农业大学草业学院草种质资源与育种团队提供，来自哈密地区（HM——AGXWB、BLK、YW）51份、伊犁地区（YL——BST、NLK、TKS、ZS）12份、昌吉地区（CJ——MNS）8份、阿勒泰地区（ALT——ALT、BEJ、HBH、JMN）35份、塔城地区（TC——EM、FY、YM、XGB）16份、博尔塔拉蒙古自治州（BZ——BL）5份。“——”前为地区，“——”后为对应的县/市。1.2试验方法1.2.1DNA的提取取2 g左右幼嫩材料的子叶和下胚轴，加入液氮快速研磨至叶片成粉状，分别放置于两个预冷过的Eppendorf管中，其中一管放入-20 ℃冰箱预存；吸取650 µL经65 ℃预热后的CTAB溶液，加入装有叶片粉末的Eppendorf管，混匀，放入65 ℃的水浴锅中，水浴30 min，每隔15 min左右轻晃1次。水浴结束后，将装有叶片粉末的Eppendorf管冷却至室温，加入325 µL氯仿-异戊醇混合液（体积比24∶1）和325 µL Tris酚。轻轻混匀，静置10 min，使其充分反应，4 ℃、12 000 r/min离心15 min；取出，缓慢吸出上清液，转入另一支Eppendorf管中。加入650 µL氯仿-异戊醇混合液（体积比24∶1），轻晃，静置15 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，取出后按照之前步骤，吸取上清液转入另一支Eppendorf管中；加入预冷的异丙醇，轻晃，-20 ℃静置90 min，4 ℃、12 000 r/min离心10 min；用75%的乙醇洗涤1~2次，加入50 µL的ddH2O或TE溶液溶解DNA，置于冰箱中保存。用紫外分光核酸测定仪检测DNA浓度，在1%琼脂糖凝胶上电泳检测DNA质量[11-14]。1.2.2SNP分型PCR扩增体系总体积10.0 µL，包括10 ng/µL基因组DNA2.0 µL、5 U/µL rTaq DNA聚合酶0.6 µL、10×Buffer（含Mg2+）1.0 µL、10 mmol/L dNTPs 0.2 µL、10 mmol/L正向和反向引物各20 µL，灭菌超纯水补足剩余体积。PCR扩增程序：95 ℃预变形3 min；95 ℃变性45 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，共50个循环；72 ℃延伸5 min。PCR产物于4 ℃保存。1.2.3数据统计与分析使用MEGA X软件[4]，采用邻接法（neighbor-joining）构建各样本的系统发育树（Kimura 2-parameter模型和Bootstrap重复1 000次）。基于SNP数据，采用admixture（v1.22）软件，分析研究材料的群体结构。针对研究群体，预先设定亚群数目（K值）为1~10进行聚类，并对聚类结果进行交叉验证，根据交叉验证错误率的谷值确定最优分群数。通过将一组存在相关性的变量转化为一组线性不相关的变量，转换后得到的这组变量即成为主成分，本研究采用EIGENSOFT（v6.0）软件基于SNP数据，进行主成分分析，得到样品的聚类情况。使用GCTA（v1.92.1）软件可以对自然群体两两个体间的亲缘关系进行估计，采用亲缘关系绘制的Kinship热图。通过次要等位基因频率（MAF）、期望等位基因数（expected allele number）、期望杂合度（expected heterozygous number）、Nei多样性指数（Nei diversity index）、多态标记数目（number of poly marker）、观测等位基因数（observed allele number）、观测杂合度（observed heterozygous number）、多态性信息含量（PIC）和香浓维纳指数（Shnnon Wiener index）等参数计算遗传多样性。1.2.4核心种质构建及验证方法采用Core Hunter软件，结合加权指数Modified Rogers distance（0.7）和Shannons Diversity Index（0.3）按照总的种质资源比例0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8和0.9的梯度进行筛选，并对筛选的材料进行基因覆盖度（CV）评价。基于遗传多样性评估，包括观测杂合度、期望杂合度、Nei多样性指数、Shnnon Wiener指数和PIC，针对所有种质材料以及筛选的核心种质进行评价。基于等位基因对核心种质与原始种质进行比对评价。基于主成分对核心种质和原始种质进行评价：利用EIGENSOFT软件基于SNP数据进行主成分分析，得到样品的聚类情况。2结果与分析2.1酶切方案与建库评估试验以Medicago_sativa: Version3作为参考基因组，选择Rsal和Haelll两种酶作为组合内切酶，选择长度在264~214 bp的序列作为SLAF标签。通过与所选用的参考基因组进行比对，统计出样品的比对率等信息。参考基因组reads数与试验开发出所有的reads数比值为98.99%，距离符合测序片段的长度占总数的88.94%，双端测序序列可以全部定位到参考基因组上，比对效率正常，说明SLAF建库成功。2.2简化基因组测序与评估对各样本所得的测序数据进行统计，结果见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.T001表1各样本SLAF标签及SNP标记统计和测序质量数据项目SLAF数量平均深度SNP数量完整性/%杂合率/%样品reads数/个GC值/%Q30值/%平均值229 06310.577 3322 69824.775.536 350 02637.9996.32HM230 4069.946 7309 68723.775.285 995 98937.8396.35ALT226 01111.126 8320 07524.565.546 565 68338.1596.31YL235 30211.484 4348 91326.786.157 107 53237.9196.21CJ236 26910.423 2331 07825.415.576 469 40038.0696.46TC218 13510.647 2305 13123.425.556 000 57238.1096.14BZ228 2529.835 4321 30524.665.115 960 97937.9096.47由表1可知，试验共获得约802.86 Mb reads数据，测序平均Q30值为96.32%，平均GC值为37.99%。2.3SLAF标签与SNP分子标记鉴定由表1可知，所有样本共开发1 374 375个SLAF标记，根据酶切方案，最终得到376 641个SLAF标签，标签的平均深度为10.577 3×，SLAF标签在每个样本中的分布数量和测序深度范围分别为218 135~236 296个、9.835 4~11.484 4×。SLAF标签和多态性SLAF标签在染色体上的状态见表2。由表2可知，在染色体上的SLAF标签共计341 895个，一共开发出多态性SLAF标签119 331个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.T002表2染色体上SLAF标签和多态性SLAF标签统计分布染色体编号SLAF标签数多态性SLAF标签数染色体编号SLAF标签数多态性SLAF标签数合计341 895119 331chr1.110 1263 411chr5.19 8593 402chr1.210 8913 760chr5.210 3973 813chr1.39 7423 149chr5.39 5273 327chr1.411 3023 566chr5.49 5133 422chr2.19 4973 187chr6.110 6484 114chr2.29 0153 178chr6.212 8885 321chr2.39 3283 219chr6.311 3614 710chr2.49 4573 170chr6.48 7643 574chr3.111 2643 752chr7.111 6354 315chr3.211 8444 215chr7.212 1854 421chr3.311 9004 004chr7.311 1003 759chr3.412 4244 360chr7.411 9274 216chr4.111 1393 608chr8.110 4333 541chr4.211 3813 847chr8.210 0973 089chr4.310 8553 453chr8.310 2753 733chr4.411 1513 676chr8.49 9703 019个绘制SLAF在染色体上的分布情况，结果见图1。由图1可知，SLAF标签在染色体上的分布情况较为均匀。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F001图1SLAF标签在染色体上的分布情况基于SLAF标签对比参考基因组，对SNP进行标记。每个样本中SNP数量分布范围为305 131~348 913个，平均SNP为322 968个；每个样本的SNP完整性分布范围为23.42%~26.78%，平均完整性为24.77%；样品杂合率为5.11%~6.15%，平均杂合率为5.53%（见表1）。SNP在染色体上的分布情况见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F002图2SNP在染色体上的分布情况由图2可知，SNP的分布具有一定的区域集中性，与吴致君等[12]的研究结果相似。2.4基于SNP分子标记的遗传进化分析2.4.1遗传多样性分析各组参试材料遗传多样性参数见表3。由表3可知，供试新疆野生黄花苜蓿品系的有效等位基因数、观测等位基因数、期望杂合度、观测杂合度、Shnnon Wiener指数的平均值分别为1.380、1.594、0.220、0.117和0.327；其中YW的观测等位基因数为1.814、有效等位基因数为1.436、Shnnon Wiener指数为0.402和期望杂合度为0.246；YM的有效等位基因数最小为1.314，BL的观测杂合度最小为0.098；FY的观测等位基因数、期望杂合度以及Shnnon Wiener指数最小，分别为1.403、0.177和0.253；BLK的有效等位基因数、观测等位基因数、期望杂合度和Shnnon Wiener指数均最大，分别为1.446、1.840、0.269和0.410；ZS的观测杂合度最大，为0.143。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.T003表3各组参试材料遗传多样性参数项目有效等位基因数观测等位基因数期望杂合度观测杂合度Shnnon Wiener指数平均值1.3801.5940.2200.1170.327AGXWB1.4061.6690.2390.1190.358ALT1.3351.4530.1880.1000.272BEJ1.3751.5530.2150.1070.317BL1.3431.4870.1950.0980.285BLK1.4461.8400.2690.1160.410BST1.3911.6100.2280.1110.338EM1.3841.5940.2240.1060.332FY1.3241.4030.1770.1200.253HBH1.4211.7300.2510.1100.379JMN1.4221.7790.2540.1330.388MNS1.4051.6580.2380.1250.355NLK1.3711.5340.2120.1210.311TKS1.3991.6270.2330.1400.347XGB1.3561.5000.2020.1270.295YM1.3141.4290.1770.1020.257YW1.4361.8140.2640.1120.402ZS1.3251.4160.1800.1430.2592.4.2群体结构分析本研究对群体遗传结构的分析是利用Admixture软件标记SNP数据，后续利用贝叶斯数学模型（Bayesian forecasting model）对种植资源进行群体结构分析。当K=1时，本研究中涉及的材料仅有一个群体结构；当K=2时，将所有材料分成两个亚群，第一亚群共31份，主要来自哈密地区，也包含塔城等地的少量材料；第二亚群共96份材料，主要来自阿勒泰地区、伊犁州和昌吉州；当K=3时，可将材料分成3个亚群，此3个亚群之间的遗传基因和遗传组成更加复杂。最大似然值越接近零，说明K值越接近实际情况。本研究中，当K=1时，最大似然值最接近零，可推测样本群体只有一个遗传结构，从而证明本研究所选用的野生黄花苜蓿种质均来自同一祖先。交叉验证见图3，遗传结构见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F003图3交叉验证10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F004图4遗传结构2.4.3PCA主成分分析材料分布情况（见图5）由图5可知，种质资源的分布情况较为密集，可以将所有材料大致分为三部分。第一部分主要由来自阿勒泰地区的材料组成，如巴里坤和哈巴河等，还有部分来自阿哥喜沃巴村的材料；第二部分主要由额敏、伊吾和昭苏等地的材料组成；第三部分为较为分散的材料，如一份来自裕民的材料、一份来自塔克斯的材料以及部分来自吉木乃的材料。大多数材料分布较为集中，说明所选材料的亲缘关系较近，与上述遗传结构分析得出结果相呼应。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F005图5PCA主成分分析材料分布情况2.4.4亲缘关系分析群体系谱不清楚或者祖代不明确等因素对群体结构分析的影响可利用G矩阵的基因组亲缘关系解决。采用G矩阵分析127份新疆野生黄花苜蓿的个体亲缘关系，结果见图6。每个小方格代表两个样本之间的基因组亲缘关系值，方格填充的颜色越接近红色则代表该亲缘关系值越大，可以说明两个个体之间的亲缘关系越近。对角线上的两个样本是某一样本与其本身的亲缘关系值，颜色接近红色，亲缘关系比较近的个体会聚类到一起，且其所在的单元格颜色越接近红色。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F006图6亲缘关系结果由图6可知，大部分个体之间的亲缘关系呈较低程度，说明所选材料的亲缘关系普遍较远，具有较高的遗传多样性，受环境影响也较为严重。2.4.5聚类分析本研究中聚类分析是利用MEGA软件基于neighbor-joining算法对材料进行系统发育树分析，结果见图7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.013.F007图7聚类分析结果由图7可知，材料被分为7类：第一类群共3份材料，分别是BEJ3、BRJ4和ZS2；第二类群共38份材料，阿哥喜沃巴8份，巴里坤17份，其余材料分别为NLK3、YW16、YW7、EM7、BEJ2、BEJ4、HBH1、HBH2、HBH8、ZS1、BST2、BST5和FY2，材料主要来源为哈密地区；第三类群共14份材料，其中YW共12份材料，其余两份材料为BST4和AGXWB2，材料来源主要在新疆哈密地区伊吾县；第四类群有35份材料，材料覆盖范围较广，包括阿勒泰地区、博乐市和昌吉地区的部分材料；第五和第六类群分别有3和4份材料，分别为XGB1、XGB3、MNS6和MNS2、MNS3、MNS4、MNS5；第七类材料共30份，材料来源主要为阿勒泰地区，包括吉木乃县和哈巴河县等地，主要包含阿勒泰地区吉木乃县和哈巴河县以及部分托克逊县等地的材料。3讨论黄花苜蓿具有较高的生产价值，因具有优异的抗逆性，常作为紫花苜蓿基因育种的“材料库”。因此，对新疆野生黄花苜蓿遗传多样性分析很有必要，可以从中筛选出适合作为育成高产、高质量紫花苜蓿品种的优质亲本材料。种质资源的遗传多样性分析可以通过形态标记进行简单评估，但是形态标记受环境影响较大，影响结果的准确性[15-21]。目前，国内利用SLAF-seq技术构建黄花苜蓿的相关研究暂未开展，但SNP分子标记技术已广泛应用于其他植物中。宋伟等[22]利用42个SNP位点的数据信息将105份自交系区分开；马骏等[23]和许理文等[24]分别使用SNP技术完成了玉米重要性状的基因定位；林萍萍等[25]利用SNP技术实现了甘蔗遗传多样性的分析和选择信号的分析；王会伟等[26]通过SLAF-seq技术开发了油莎豆的SNP和InDel位点，并进行了遗传分析；田倩等[27]通过SLAF-seq技术对白皮松进行了SNP分子标记的开发；董辉等[28]通过SLAF-seq技术构架了栽培草莓的高密度遗传图谱。畜牧业中已有相关的应用先例。张顺进等[29]对红牛进行了全基因组测序和关键基因的SNP在育种研究中的发掘；萧祖弸等[30]对奶牛生产性状进行了相应的SNP分子标记研究；朱兰等[31]以及胡瑞雪[32]分别对黑山羊和杂种羊的遗传多样性和羊毛生长性能进行研究。本研究基于SLAF-seq技术对所选127份新疆野生黄花苜蓿种质资源进行测序分析，测序平均Q30值为96.32%，平均GC值为37.99%，定位到参考基因组上的reads数占总reads数的98.99%，此结果说明SLAF建库成功。绘制SLAF和SNP在染色体上的分布图，结果显示，二者在染色体上的分布较为均匀，同时具有一定的区域集中性。基于SNP分子标记对新疆野生黄花苜蓿种质资源进行了遗传进化分析，遗传多样性分析结果为居群YW的遗传多样性最高，BL的遗传多样性最低；群体结构分析确定材料来源于同一祖先；PCA分析将材料分为三部分，结果与聚类分析和群体结构分析存在一定出入。推测其原因可能是种质资源的遗传背景不明确，无法进行细分，也存在引物较少的可能，检测位点无法全覆盖等，与宋丽娜[33]的研究结果基本一致。4结论本研究利用SLAF-seq技术开发了127份新疆野生黄花苜蓿的SNP分子标记，共有376 641个SLAF标签，SLAF标签在染色体上的分布情况较为均匀，SNP在染色体上的分布情况具有区域集中性。通过对SNP数据的平均完整度和杂合度分析，发现所选取的基因具有较高的纯合度。基于SNP进行遗传进化分析，说明所选材料来源为同一祖先，为进一步发掘黄花苜蓿中的优良性状以及为高质量紫花苜蓿育种提供一定的遗传基础。