益生菌被定义为一种活的微生物，当给予足够量时，对宿主的健康有益[1]。由于大多数芽孢杆菌不具有致病性，因此常被用作改善人类和动物健康的膳食补充剂[2-4]。解淀粉芽孢杆菌是一种广泛存在于自然界中的革兰氏阳性菌株，可在生产过程中产生各种抑菌代谢产物，如多肽类、脂肽类及抑菌蛋白类等[5]。目前，解淀粉芽孢杆菌已大量应用于动物生产、环境保护、果蔬保鲜等各方面[6-8]。随着解淀粉芽孢杆菌的广泛应用，其安全问题也逐渐受到关注。有报道称，益生菌可引起菌血症、败血症、心内膜炎、全身感染、胃肠道副作用等不良反应[9]。因此，安全性评估已成为益生菌临床应用前的强制性标准。我国农业农村部于2021年制定了《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》（下称《指南》）指导益生菌应用前的安全性评价。本研究从解淀粉芽孢杆菌DZ01菌株的溶血性、有害代谢产物检测、抗菌药物最低抑菌浓度（MIC）检测、动物致病性、抑菌活性等方面进行安全性综合评价，为解淀粉芽孢杆菌DZ01的安全使用提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验菌株及试验动物解淀粉芽孢杆菌DZ01分离自杜仲，指示菌株购自中国工业微生物菌种保藏管理中心，菌种均保藏于山东宝来利来生物工程股份有限公司生物工程研究院菌种资源保藏中心。昆明小鼠购自济南朋悦实验动物繁育有限公司。1.1.2主要试剂和仪器设备明胶液化管、氨基酸脱羧酶生化反应管、哥伦比亚血平皿、芽孢杆菌培养基、NA培养基、TSA培养基和MH肉汤购自青岛海博生物技术有限公司。抗生素购自索莱宝生物科技有限公司。BS-230全自动生化分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、DHP-9082电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器有限公司）。1.2试验方法1.2.1菌株DZ01活化及形态观察取斜面菌种，划线接种于NA平板，37 ℃培养24 h，观察菌落形态和菌体微观形态。1.2.2菌株DZ01有害代谢产物检测（1）明胶液化试验。挑取单菌落接种于明胶液化管中，37 ℃培养48~96 h，培养结束后4 ℃冰箱放置20 min，若变为固态则为阴性，若仍然为液态则为阳性。（2）氨基酸脱羧试验。挑取单菌落接种于氨基酸脱羧酶生化反应管中，37 ℃培养24 h，变为绿色为阳性，不变色（黄色）为阴性。1.2.3菌株DZ01溶血试验挑取单菌落划线接种于哥伦比亚血平皿上，37 ℃培养24 h，观察是否有溶血现象。1.2.4菌株DZ01抗菌药物MIC测定根据美国临床和实验室标准协会（CLSI）药敏试验方法中的肉汤二倍梯度稀释法，测定庆大霉素、卡那霉素、红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素、链霉素和万古霉素8种抗菌药物对菌株DZ01的MIC，37 ℃培养24 h，观察结果。1.2.5菌株DZ01动物致病性试验（1）腹腔注射动物致病性试验。参考《中国药典》微生态活菌制品毒性试验，稍作修改，进行腹腔注射动物致病性试验。将40只体重为25~27 g小鼠（雌、雄各半）分为生理盐水组和菌株DZ01组（1.0×1010 CFU/0.3 mL），每组20只，注射1次，连续观察5 d。每天称重，统计体重，试验结束处死解剖，统计脏器指数，进行细菌易位试验，检测血常规和血清生化指标。血常规指标由周阳宠物医院进行检测，血清生化指标使用迈瑞BS-230生化分析仪进行检测。脏器指数=脏器重量/小鼠体重×100%(1)（2）经口灌胃动物致病性试验。经口灌胃动物致病性试验参照《饲料毒理学评价 亚急性毒性试验》（GB/T 23179—2008）和《饲料安全性评价 亚急性毒性试验》（NY/T 1031—2006）进行。80只22~24 g小鼠（雌、雄各半）分为生理盐水组、高剂量组（1.0×1010 CFU/0.2 mL）、中剂量组（1.0×109 CFU/0.2 mL）和低剂量组（1.0×108 CFU/0.2 mL），每组20只，雌、雄各半，每天灌胃1次，连续灌胃28 d。试验期间每7 d统计一次体重，试验结束处死解剖，统计脏器指数，进行细菌易位试验，检测血常规和血清生化指标。1.2.6解淀粉芽孢杆菌DZ01抑菌活性试验吸取0.6 mL经稀释/浓缩指示菌菌液（109 CFU/mL）加入灭菌培养平皿中，吸取NA培养基（化脓性链球菌TSA）16 mL倒入灭菌培养皿中，摇匀，凝固后打孔，加入40 μL拟评价菌株上清液，37 ℃过夜培养，测量抑菌圈大小。1.3数据统计与分析采用Excel 2010软件对试验数据进行初步整理，SPSS 22.0软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1菌株DZ01菌落形态和菌体形态（见图1）由图1可知，解淀粉芽孢杆菌DZ01在NA培养基上37 ℃培养24 h，形成圆形白色菌落，边缘不规则，表面粗糙、干燥有褶皱、有凸起，菌落不透明。菌体革兰氏染色阳性杆菌，单个细胞（0.6~0.8）μm×（1.6~2.5）μm，孢子端生。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.F001图1菌株DZ01菌落形态和菌体形态2.2菌株DZ01溶血试验结果（见图2）由图2可知，菌株DZ01在血液琼脂平板培养24 h，观察菌落周围未发现溶血现象，说明细菌不产生溶血素。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.F002图2菌株DZ01溶血试验结果2.3菌株DZ01的有害代谢产物检测2.3.1菌株DZ01明胶液化结果（见图3）由图3可知，明胶反应管4 ℃冰箱放置20 min后，试验管明胶变为固体，说明菌株不产生明胶酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.F003图3菌株DZ01明胶液化结果2.3.2菌株DZ01氨基酸脱羧试验结果（见图4）由图4可知，氨基酸脱羧酶生化反应管于37 ℃培养箱培养24 h，生化反应管变为黄色，说明试验菌株代谢产物中不含有氨基脱羧酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.F004图4菌株DZ01氨基酸脱羧试验结果2.4菌株DZ01对抗菌药物的MIC值（见表1）根据《指南》中芽孢杆菌属对不同抗菌药物临界值判定菌株对抗菌药物的敏感性：MIC值≤临界值时，菌株对抗菌药物敏感；MIC值临界值时，菌株对抗菌药物耐药。由表1可知，解淀粉芽孢杆菌DZ01对所有测定的抗菌药物敏感。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T001表1菌株DZ01对抗菌药物的MIC值药物名称安全性评价指南标准/(mg/L)MIC值/(mg/L)判定结果庆大霉素40.125敏感卡那霉素80.250敏感红霉素40.125敏感克林霉素40.500敏感四环素88.000敏感氯霉素88.000敏感链霉素80.500敏感万古霉素40.125敏感2.5菌株DZ01动物致病性试验2.5.1腹腔注射菌株DZ01致病性试验结果在试验期5 d内，各试验组小鼠被毛体态、生长、行为、精神状态均表现良好，采食、饮水、排泄均正常，无中毒及死亡现象。（1）腹腔注射菌株DZ01对小鼠体重的影响（见表2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T002表2腹腔注射菌株DZ01对小鼠体重的影响性别组别0 d1 d2 d3 d4 d5 d雌鼠对照组25.78±1.8927.84±1.8028.94±2.2129.85±2.5030.58±2.2930.80±2.29DZ01组26.11±1.1225.42±1.5026.90±1.7428.84±2.0430.29±2.7730.75±2.52雄鼠对照组27.24±1.4530.70±1.2131.72±2.0032.31±0.2933.66±0.8234.38±0.89DZ01组27.50±1.3228.84±1.3030.36±0.9432.29±1.3833.58±1.3834.82±2.03注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05）；表3、表4、表6、表7、表9与此同。g由表2可知，腹腔注射菌株DZ01后，两组小鼠的体重随着日龄的增加而增加（P0.05）。（2）腹腔注射菌株DZ01对小鼠脏器指数的影响（见表3）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T003表3腹腔注射菌株DZ01对小鼠脏器指数的影响组别心脏指数肝脏指数脾脏指数肺脏指数肾脏指数胸腺指数对照组0.57±0.115.31±0.420.40±0.07b0.69±0.081.26±0.160.43±0.12DZ01组0.53±0.065.50±0.510.70±0.07a0.81±0.131.43±0.190.56±0.06%由表3可知，腹腔注射菌株DZ01后，小鼠脾脏偏大，且脾脏指数显著高于对照组（P0.05），其余脏器指数与对照组相比差异均不显著（P0.05）。（3）腹腔注射菌株DZ01对小鼠血常规指标的影响（见表4）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T004表4腹腔注射菌株DZ01对小鼠血常规指标的影响组别白细胞数目/(×109/L)红细胞数目/(×1012/L)血红蛋白/(g/L)血细胞比容/%平均红细胞体积/fL平均红细胞血红蛋白含量/pg血小板数目/(×109/L)对照组5.25±0.648.57±1.98117.57±21.1144.35±6.5852.30±4.3815.35±0.491 073.00±380.32DZ01组5.23±1.817.89±1.42120.88±8.3646.75±6.3456.83±5.8115.43±1.631 102.00±278.56由表4可知，与对照组相比，腹腔注射小鼠的各血常规指标差异均不显著（P0.05），说明腹腔注射DZ01对小鼠的血液指标无不利影响。（4）腹腔注射菌株DZ01对小鼠血清生化指标的影响（见表5）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T005表5腹腔注射菌株DZ01对小鼠血清生化指标的影响项目对照组DZ01组血糖/(mmol/L)5.40±1.955.88±1.99谷丙转氨酶/(U/L)32.17±16.4431.10±16.50谷草转氨酶/(U/L)91.73±28.4090.44±18.57碱性磷酸酶/(U/L)69.77±15.6175.79±25.99白蛋白/(g/L)22.54±2.0724.27±3.54总蛋白/(g/L)41.80±3.6944.59±6.54球蛋白/(g/L)19.24±2.5120.31±3.25甘油三酯/(mmol/L)1.05±0.340.93±0.30总胆固醇/(mmol/L)1.62±0.301.91±0.41肌酐/(μmol/L)14.83±2.7215.16±2.66尿酸/(mmol/L)138.77±51.75138.80±70.13尿素氮/(mmol/L)8.78±1.428.09±1.36白球比1.17±0.151.19±0.11由表5可知，两组小鼠血清生化指标差异均不显著（P0.05）。结果表明，腹腔注射菌株DZ01未对小鼠的肝脏功能、肾脏功能和血糖血脂造成不良影响。（5）腹腔注射菌株DZ01细菌易位试验结果。试验结束后，小鼠在无菌条件下进行解剖，取心脏、肝脏、脾脏、肺脏和肾脏，并用灭菌的手术刀将以上各脏器切开，用灭菌棉签擦拭脏器切面，涂布于LB固体培养基平板上，37 ℃培养箱中培养24~48 h后，无芽孢菌落生长。由此可见，脏器无芽孢菌细菌移位现象发生。2.5.2菌株DZ01经口灌胃致病性试验结果（1）灌胃菌株DZ01对小鼠体重的影响（见表6）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T006表6灌胃对小鼠体重的影响性别组别0 d7 d14 d21 d28 d雌鼠对照组23.04±0.8729.93±1.81a31.26±1.3934.83±1.6337.40±1.99低剂量组22.68±0.7429.91±2.09a31.51±2.3135.05±2.3136.42±3.55中剂量组22.75±0.8229.92±2.90a31.92±2.6635.16±0.6335.55±1.03高剂量组22.68±0.7227.60±2.91b30.36±3.1533.75±1.5635.37±1.40雄鼠对照组23.58±1.0932.85±2.4535.80±2.3439.98±1.7641.72±1.04低剂量组23.57±1.0233.05±2.0535.53±2.4139.60±2.1440.90±2.72中剂量组23.67±0.8732.27±2.4635.49±1.5039.57±1.6041.59±1.97高剂量组23.56±0.9331.44±2.3734.88±2.0238.11±1.8040.63±1.87g由表6可知，连续灌服108~1010 CFU/mL解淀粉芽孢杆菌DZ01 28 d，除第7 d高剂量组雌鼠体重显著低于其余3组外（P0.05），其余时间雌、雄小鼠体重与对照组相比差异不显著（P0.05），且小鼠增重正常。（2）灌胃菌株DZ01对小鼠血常规指标的影响（见表7）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T007表7灌胃菌株DZ01对小鼠血常规指标的影响组别白细胞数目/(×109/L)淋巴细胞数目/(×109/L)单核细胞数目/(×109/L)红细胞数目/(×1012/L)血红蛋白/(g/L)血小板数目/(×109/L)平均血小板体积/fL对照组5.25±3.904.03±2.920.13±0.147.86±0.50126.67±4.22985.17±456.545.62±0.52低剂量组4.79±1.503.76±1.430.13±0.468.04±0.33128.63±4.811 201.13±302.865.38±0.23中剂量组4.83±1.783.95±1.470.11±0.357.80±0.59124.75±7.551 125.38±189.785.31±0.11高剂量组5.05±2.023.96±1.550.11±0.357.63±0.84122.75±14.301 117.38±408.345.41±0.30由表7可知，灌胃解淀粉芽孢杆菌DZ01菌悬液28 d，各剂量组小鼠血常规指标与对照组相比差异均不显著（P0.05）。（3）灌胃菌株DZ01对小鼠血清生化指标的影响（见表8）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T008表8灌胃菌株DZ01对小鼠血清生化指标的影响项目对照组低剂量组中剂量组高剂量组白球比1.88±0.282.02±0.182.05±0.351.98±0.33谷丙转氨酶/(U/L)117.07±44.29ab93.38±11.95b151.66±98.80a91.28±20.00b谷草转氨酶/(U/L)203.75±51.09185.62±20.96170.75±24.91183.97±35.53碱性磷酸酶/(U/L)56.88±32.5451.21±16.5051.23±15.9259.37±30.00球蛋白/(g/L)18.39±2.9816.75±1.6216.97±2.4617.44±2.06总蛋白/(g/L)52.35±4.4050.42±2.9050.30±4.3451.42±2.50白蛋白/(g/L)33.96±2.3433.66±1.7934.13±2.2133.98±2.47血糖/(mmol/L)8.73±2.068.48±2.129.23±2.4510.29±2.29尿素氮/(mmol/L)10.35±1.069.88±1.1310.79±1.229.82±1.67尿酸/(mmol/L)130.71±37.08118.47±31.00125.82±31.52127.16±21.23总胆固醇/(mmol/L)2.43±0.522.28±0.462.36±0.292.56±0.45甘油三酯/(mmol/L)1.13±0.201.28±0.301.15±0.411.24±0.14注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05）。由表8可知，各剂量组小鼠与肝功、肾功相关的各项指标及血糖、血脂和免疫指标与对照组相比差异均不显著（P0.05），说明连续灌服108～1010 CFU/mL解淀粉芽孢杆菌DZ01 28 d并未对小鼠的肝脏功能、肾脏功能和血糖、血脂造成不良影响。（4）灌胃菌株DZ01对小鼠脏器指数的影响（见表9）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T009表9灌胃菌株DZ01对小鼠脏器指数的影响组别心脏指数肝脏指数脾脏指数肺脏指数肾脏指数胸腺指数对照组0.54±0.055.93±0.340.36±0.05bc0.64±0.091.45±0.260.34±0.09低剂量组0.58±0.085.75±0.600.38±0.06ab0.71±0.121.37±0.120.37±0.14中剂量组0.56±0.075.62±0.340.37±0.06b0.64±0.081.37±0.110.35±0.12高剂量组0.54±0.055.56±0.350.43±0.09a0.70±0.251.36±0.100.38±0.15%由表9可知，高剂量组小鼠脾脏指数显著高于对照组（P0.05）。各组小鼠其余脏器指数差异均与对照组差异不显著（P0.05）。由于脾脏与机体的免疫功能相关，脾脏指数增高可能与免疫力增强有关，无病理学意义，说明灌胃解淀粉芽孢杆菌DZ01菌悬液对小鼠脏器指数无有害影响。（5）灌胃菌株DZ01细菌易位试验结果。灌胃菌株DZ0128 d后，各组小鼠的脏器上均未发现芽孢细菌移位现象。2.6菌株DZ01对指示菌抑菌活性的试验结果（见表10）由表10可知，解淀粉芽孢杆菌DZ01对蜡样芽孢杆菌CICC 10352和金黄色葡萄球菌CICC 10306抑菌活性最强，对大肠杆菌CICC 23657、黏质沙雷菌CICC 10355、环状芽孢杆菌CICC 10353和化脓链球菌CICC 10356抑菌活性相当，而对铜绿假单胞菌CICC 21636和粪肠球菌CICC 23658无抑菌活性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.016.T010表10菌株DZ01对指示菌抑菌活性结果指示菌抑菌圈直径大肠杆菌CICC 236579.50±0.50金黄色葡萄球菌CICC 1030616.50±0.50黏质沙雷菌CICC 103558.50±0.50环状芽孢杆菌CICC 103538.00±0.50化脓链球菌CICC 103568.00±1.00蜡样芽孢杆菌CICC 1035214.17±0.29铜绿假单胞菌CICC 216360粪肠球菌CICC 236580注：数据含打孔孔径（6 mm）。mm3讨论随着益生菌的应用越来越广泛，其安全问题也引起了广泛的关注。临床应用前，需要使用合适的方法对益生菌的安全性进行评价[10]。3.1解淀粉芽孢杆菌DZ01动物致病性试验结果分析目前，已经开展了一些畜禽用益生菌株的安全性研究，如解淀粉芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳球菌和粪肠球菌等[11-15]。裘纪莹等[16]研究了解淀粉芽孢杆菌NCPSJ7菌株菌悬液对小鼠的急性毒性，结果表明，小鼠饮水、进食、运动等行为均未受影响，无明显中毒现象，未出现死亡，肝功能及血常规指标无显著变化，说明该菌株的安全性较高。王岩等[17]通过急性毒性、慢性毒性、细菌易位等安全性试验评估了解淀粉芽孢杆菌SSY1株的安全性，结果表明，低、中、高剂量组小鼠均健康存活，血液学指标、血液生化指标及脏器系数与对照组相比均差异不显著，且无菌株易位现象，表明解淀粉芽孢杆菌SSY1株的安全性良好。本试验采用腹腔注射、经口灌胃评价了解淀粉芽孢杆菌DZ01株的安全性，依据益生菌临床实际用量（107 CFU/mL），腹腔注射和经口灌胃高剂量组的剂量分别为1.0×1010 CFU/0.3 mL和1.0×1010 CFU/0.2 mL，已超过实际使用剂量的100倍。试验过程中小鼠健康存活，体重增加正常，血常规和血清生化指标及脏器指数与对照组相比差异不显著，未发现菌株易位。因此，本试验所用菌株DZ01为非致病性菌株，安全性较好。3.2解淀粉芽孢杆菌DZ01抗生素敏感性试验结果分析由于抗生素的广泛使用加速了食品、动物和人类细菌中抗生素耐药性的传播[18]。因此抗生素敏感性可作为菌株是否能应用于饲料添加剂方面的一个重要特征，也是菌株体外安全评价的重要环节[19-20]。某些细菌是抗微生物药物抗性基因的储存库，能够通过基因水平转移（HGT）这种特性[21-24]，因此需要对临床应用的益生菌进行抗性分型，以选择安全的菌株[25]。本研究分析了解淀粉芽孢杆菌DZ01对8种抗生素的敏感性，结果表明，菌株对庆大霉素、卡那霉素、红霉素、克林霉素、四环素、氯霉素、链霉素和万古霉素8种抗生素敏感，可保证其安全使用。3.3解淀粉芽孢杆菌DZ01溶血活性及有害代谢产物检测结果分析溶血活性是一个重要的生物安全指标，即使菌株处在安全合理推定（QPS）状态或使用多年，也必须按照欧洲食品安全局的建议进行溶血活性检测[26]。菌株溶血素的产生可能导致红细胞溶解而产生溶血。明胶酶是微生物致病的决定因素之一，细菌通过其蛋白质降解能力侵入宿主组织。虽然在有益微生物中不经常观察到明胶酶，但入侵组织的病原体经常表现出明胶酶活性[10]。生物胺是在代谢过程中由特定氨基酸的脱羧作用产生的耐热性有机氮化合物，而摄入少量生物胺可引起许多不良反应，如低血压、心动过缓、头痛等[27]。因此，益生菌在投入临床使用前有必要对其溶血活性、明胶酶和生物胺等进行测定。本研究检测了解淀粉芽孢杆菌DZ01溶血活性，明胶酶及氨基酸脱羧酶活性，结果表明，菌株未发生溶血，明胶液化和氨基酸脱羧阴性，说明菌株不产生溶血素，不产生生物胺等有害代谢产物。3.4解淀粉芽孢杆菌DZ01对指示菌的抑菌活性分析由于抗生素残留带来的生态环境污染日益严重，许多国家已严禁在饲料中加入抗生素。有研究发现，解淀粉芽孢杆菌会产生某些代谢产物而对病原菌产生拮抗活性，有望成为抗生素的替代品[28]。目前，已经开展了许多对解淀粉芽孢杆菌抑菌特性的研究。尹灿[29]使用牛津杯法检测到解淀粉芽孢杆菌W26和40c1a上清液对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌具有抑菌活性。杜海涛[30]使用牛津杯法检测到解淀粉芽孢杆菌TL106对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、副猪嗜血杆菌和链球菌具有一定的抑制作用。本研究使用琼脂扩散法检测解淀粉芽孢杆菌DZ01的抑菌活性，结果显示，菌株对蜡样芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、黏质沙雷菌、环状芽孢杆菌和化脓链球菌均具有抑菌活性，而对铜绿假单胞菌和粪肠球菌无抑菌活性。《指南》中要求，若菌株上清液对一种或一种以上参考菌株出现抑菌活性，需要对抑菌物质进行鉴定，确定其是否为人或动物用抗菌药物。本研究使用的DZ01菌株对6种参考菌株有抑菌活性，因此下一步需要对抑菌物质进行鉴定。4结论本研究通过菌株溶血性、氨基酸脱羧和明胶液化试验、抗菌药物敏感性、腹腔注射、经口灌胃、抑菌活性等进行安全性综合评价，证明了解淀粉芽孢杆菌DZ01的安全性良好。