紫苏（Perilla frutescens）又名白苏、荏子、唐紫苏和皱叶苏，是唇形科紫苏属的一年生草本植物[1-2]，其叶、茎、籽等均可为药[3]。紫苏是一种药食同源的两用植物[4-5]。紫苏植株中富含黄酮[6]、多糖[7]、咖啡酸以及花青素等活性成分[8]，具有抗菌[9]、抗病毒[10]和抗氧化等药理功效[11]。近年来，我国禁止在饲料中添加促生长类抗生素[12]。因此，养殖业亟须寻找一种优质、环保、无公害的添加剂作为畜禽抗生素的替代品。因紫苏总黄酮具有多种生物学活性，可将其作为原料研发出各类功能型饲料添加剂。王珍珊等[13]研究发现，在基础饲粮中添加4.0%紫苏植物提取物，可以提高育肥猪对营养物质的吸收效率，改善育肥猪的胴体品质。因此，紫苏提取物作为一种新型饲料添加剂具有较大的开发价值和广阔的应用前景。目前，关于植物中黄酮类化合物的提取研究较多，但对紫苏叶总黄酮的超声波辅助提取工艺进行优化及抗氧化活性的研究鲜见报道。因此，本试验以紫苏叶为研究对象，采用超声波辅助法提取紫苏叶中总黄酮，考察乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间对紫苏叶总黄酮得率的影响，应用正交试验法优化其提取工艺，以期为紫苏叶总黄酮提取的工业化生产及其资源开发提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂紫苏叶采自广西壮族自治区南宁市江南区鸿运农场。硝酸铝、亚硝酸钠、氢氧化钠等均为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司；无水乙醇（分析纯）购自东莞市勋业化学试剂有限公司；芦丁标准品、抗坏血酸标准品购自福州飞净生物科技有限公司；二苯基苦基肼自由基（DPPH）购自上海联迈生物工程有限公司；过氧化氢（分析纯）购自济南凯骏化工有限公司；水杨酸购自河南金顺化工产品有限公司。水为《分析实验室用水规格和试验方法》（GB/T 6682—2008）规定一级水。1.2仪器设备UV759CRT紫外光度计（青岛聚创华业公司），ESJ220-4A电子分析天平（沈阳龙腾电子有限公司），Spex组织研磨仪（北京信立方科技发展股份有限公司），KYX-480HQG超声辅助提取仪（江西鼎技科学仪器有限公司），Master Touch超纯水仪（上海和泰仪器有限公司），TGL-16M冷冻离心机（北京大龙兴创实验仪器股份公司），TWS-12电热恒温水浴锅（上海劳达贸易有限公司），BXH-130S电烘箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）。1.3试验方法1.3.1样品的预处理将采摘的紫苏叶于烘箱中40 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，过80目筛，放入玻璃容器中储存。1.3.2芦丁标准曲线工作液的配制准确称取芦丁标准品10 mg（精确至0.001 mg）于50 mL棕色容量瓶中，加入适量无水乙醇后，置于超声辅助提取仪中充分溶解后，用无水乙醇定容至刻度，即得浓度为200 mg/L芦丁标准储备液。取7支25 mL棕色容量瓶，分别吸取浓度为200 mg/L芦丁标准储备液0、1、2、3、4、5、6 mL于容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液2 mL，摇匀后静置15 min；再次加入10% Al(NO)3溶液1 mL，摇匀后静置10 min，依次加入4% NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容至刻度后静置15 min，即得到浓度分别为0、8、16、24、32、40、48 mg/L的系列标准曲线工作溶液，以浓度为0 mg/L的空白试剂为参比溶液。使用紫外可见分光光度计测定510 nm处吸光度。1.3.3紫苏叶总黄酮的提取及含量的测定称取样品紫苏叶粉末1.0 g（精确至0.01 g）于100 mL具塞试管中，按照液料比20 mL/g加入60%的乙醇溶液进行提取，于超声辅助提取仪中进行提取，提取温度为50 ℃，提取时间为40 min，提取完毕后于6 000 r/min离心20 min，将上清液转移至200 mL棕色容量瓶中。残渣以相同条件提取2次，合并提取液，用70%乙醇溶液定容至刻度，即得待测液。准确吸取3 mL待测液于25 mL棕色容量瓶，按照“1.3.2”步骤进行显色反应，测定510 nm处吸光度。根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的质量浓度。X=c×V×Dm×1 000×100% (1)式中：X为紫苏叶总黄酮含量（%）；c为标准曲线计算得到的待测试样液总黄酮浓度（g/L）；V为提取液体积（mL）；D为稀释倍数；m为试样的质量（g）。1.3.4单因素试验以紫苏叶总黄酮得率为考核指标，考察乙醇浓度、液料比、提取温度和提取时间对紫苏叶总黄酮得率的影响。单因素试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.T001表1单因素试验因素水平设计因素水平乙醇浓度（A）/%40、50、60、70、80液料比（B）/(mL/g)10、15、20、25、30提取温度（C）/℃30、40、50、60、70提取时间（D）/min25、35、45、55、651.3.5正交试验设计在单因素试验结果基础上，以紫苏叶总黄酮得率为考核指标，设计4因素3水平的L9(34)正交试验，其因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.T002表2L9（34）正交试验因素水平设计水平A/%B/(mL/g)C/℃D/min1501550452602060553702570651.3.6紫苏叶总黄酮提取物体外抗氧化活性（1）DPPH自由基清除试验。参考文献[14]至文献[17]，精确吸取不同浓度的紫苏叶总黄酮粗提液（50、100、200、400、600、800 mg/L）2 mL于25 mL棕色容量瓶中，依次加入浓度为100 mg/L DPPH储备液2 mL，摇匀后于黑暗处静置30 min，测定510 nm处吸光度A1；以无水乙醇代替DPPH储备液，按照上述方法处理后测定510 nm处吸光度A2；以2.0 mL无水乙醇代替紫苏叶总黄酮粗提液，向其加入2 mL 100 mg/L DPPH储备液，按照上述方法处理后测定510 nm处吸光度A0；以VC为阳性对照，计算半数抑制浓度（IC50）。DPPH自由基清除率计算公式为：DPPH自由基清除率=1-A1-A2A0×100% (2)（2）羟自由基清除试验。参考文献[18]至文献[20]，精确吸取不同浓度的紫苏叶总黄酮粗提液（50、100、200、400、600、800 mg/L）2 mL于25 mL棕色容量瓶中，依次加入6 mmol/L FeSO4、8 mmol/L水杨酸、8.8 mmol/L H2O2各2.0 mL，充分摇匀后于37 ℃水浴锅中反应30 min，以蒸馏水调零后，测定样品反应液510 nm处吸光度A1；以蒸馏水代替H2O2，按照上述方法处理后测定510 nm处吸光度A2；以蒸馏水代替紫苏叶总黄酮粗提液，按照上述方法处理后测定510 nm处吸光度A0；以VC为阳性对照，计算半数抑制浓度（IC50）。羟自由基清除率计算公式为：羟自由基清除率=1-A1-A2A0×100% (3)2结果与分析2.1芦丁标准曲线以芦丁浓度为横坐标（x，mg/L），吸光度为纵坐标（y）绘制标准曲线，见图1。由图1可知，线性回归方程为y=0.016 5x+0.102，相关系数R2=0.999。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F001图1芦丁标准曲线2.2单因素试验结果2.2.1乙醇浓度对紫苏叶总黄酮得率的影响（见图2）由图2可知，总黄酮得率随着乙醇浓度的增加呈先增加后降低趋势。当乙醇浓度为60%时，紫苏叶总黄酮得率达到最大值，黄酮得率为3.56%。原因可能是乙醇浓度较低时，水分含量相对较高，样品中总黄酮未能完全溶解，从而导致总黄酮得率较低[21-22]；乙醇浓度过高则极性降低，样品中脂溶性和醇溶性物质溶出，故黄酮得率会有所降低。因此，选择50%、60%和70%的乙醇浓度进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F002图2乙醇浓度对紫苏叶总黄酮得率的影响2.2.2液料比对紫苏叶总黄酮得率的影响（见图3）由图3可知，随着液料比的逐渐增加，紫苏叶总黄酮得率呈先增大后降低趋势。在液料比为10~20 mL/g之间时，随着液料比的增加紫苏叶总黄酮得率逐渐增大；当液料比为20 mL/g时，紫苏叶总黄酮得率达到最大值，其提取率为3.76%；继续增加液料比，紫苏叶总黄酮得率反而有所降低。因此，从提取黄酮得率效果与经济成本等因素考虑，选择液料比15、20、25 mL/g进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F003图3液料比对紫苏叶总黄酮得率的影响2.2.3提取温度对紫苏叶总黄酮得率的影响（见图4）由图4可知，随着提取温度的不断升高，紫苏叶总黄酮得率逐渐增加，原因可能是温度的上升加速了分子间的热力学运动，分子间的运动有利于样品中黄酮类化合物的溶出[23]。当提取温度上升至60 ℃时，紫苏叶总黄酮得率达到最大值3.89%。继续升高提取温度紫苏叶总黄酮得率反而有所降低，原因可能是高温造成黄酮类化合物的降解[24]，从而导致紫苏叶总黄酮提取率降低。因此，选择提取温度50、60、70 ℃进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F004图4提取温度对紫苏叶总黄酮得率的影响2.2.4提取时间对紫苏叶总黄酮得率的影响（见图5）由图5可知，当提取时间在25~55 min之间时，紫苏叶总黄酮得率随着提取时间的延长而增加；当提取时间为55 min时，紫苏叶总黄酮得率达到最大值3.98%；继续延长提取时间，紫苏叶总黄酮得率反而有所降低，原因可能是黄酮类化合物处于长时间加热过程中，导致其结构被破坏[25-26]，从而使紫苏叶总黄酮得率降低。因此，选择提取时间45、55、65 min进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F005图5提取时间对紫苏叶总黄酮得率的影响2.3正交试验极差、方差分析结果（见表3、表4）由表3可知，各因素对紫苏叶总黄酮得率影响的主次顺序为：提取温度乙醇浓度液料比提取时间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.T003表3正交试验极差分析结果项目ABCD总黄酮得率/%111113.65212223.25313333.57421232.59522313.54623123.16731323.35832133.56933212.67K110.479.5910.379.86K29.2910.358.519.76K39.589.4010.469.72k13.493.203.463.29k23.103.452.843.25k33.193.133.493.24R0.390.320.650.05最优组合A1B2C3D1由表4可知，提取温度对紫苏叶总黄酮得率影响达到极显著水平（P0.01）；乙醇浓度与液料比对紫苏叶总黄酮得率影响达到显著水平（P0.05）；提取时间对紫苏叶总黄酮得率无显著影响（P0.05），方差分析结果与极差分析结果一致。综合考察极差分析和方差分析的结果可知，紫苏叶总黄酮最优提取工艺组合为A1B2C3D1，即提取溶剂乙醇浓度50%、液料比20 mL/g、提取温度70 ℃和提取时间45 min。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.T004表4正交试验方差分析结果项目偏差平方和自由度均方F值P值A0.252 120.126 142.030.05B0.168 520.084 328.100.05C0.807 820.403 9134.600.01D0.003 520.001 80.600.05误差0.027 290.003 0总和1.259 017注：F0.05（2，2）=19.00，F0.01（2，2）=99.00；P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。根据正交试验筛选的最优提取工艺条件A1B2C3D1进行3次验证试验，3次平行试验的紫苏叶总黄酮得率的平均值为4.05%，高于表3中的其他试验组合的提取结果。因此，可确定A1B2C3D1为紫苏叶总黄酮提取工艺的最优组合。2.4体外抗氧化活性试验2.4.1紫苏叶总黄酮对DPPH自由基清除率的影响（见图6）由图6可知，在所测浓度范围内紫苏叶总黄酮与VC对DPPH自由基的清除能力随着浓度的增加而呈上升趋势，表现出良好量效关系，紫苏叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力略低于VC。紫苏叶总黄酮清除自由基的能力与浓度相关，其IC50为160 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F006图6紫苏叶总黄酮对DPPH自由基清除率的影响2.4.2紫苏叶总黄酮对羟自由基清除率的影响（见图7）由图7可知，紫苏叶总黄酮对羟自由基清除率随着其浓度的增加呈上升趋势，表现出良好的量效关系。在质量浓度低于100 mg/L时，紫苏叶总黄酮与VC对羟自由基清除率较低且二者差异不显著，但紫苏叶总黄酮对羟自由基清除率整体低于VC对羟自由基清除率，其IC50为196 mg/L。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.018.F007图7紫苏叶总黄酮对羟自由基清除率的影响3结论本研究以紫苏叶为研究对象，在单因素试验基础上通过正交试验优化总黄酮提取工艺，并探讨紫苏叶总黄酮的抗氧化活性。结果表明，4个因素对紫苏叶总黄酮得率影响的主次顺序为：提取温度乙醇浓度液料比提取时间。紫苏叶总黄酮最优提取工艺参数为乙醇浓度50%、液料比为20 mL/g、提取温度70 ℃和提取时间45 min。在此条件下，紫苏叶总黄酮得率为4.05%。紫苏叶总黄酮对DPPH自由基与羟自由基具有较强的清除作用，其IC50值分别为160 mg/L和196 mg/L。紫苏叶总黄酮对羟自由基清除率表现出较强的抗氧化性能，可作为天然抗氧化剂应用于饲料研发、食品、药品等行业。本研究结果可为后续紫苏叶总黄酮的分离与提纯提供参考。