我国清香型白酒生产企业数量较多，2020年产生的酒糟多达100余万t[1-2]。清香型白酒糟产量大，但是水分含量高，易腐败，不宜长期贮存和长途运输[3-4]。清香型白酒糟主要组成为残余高粱、大麦和豌豆等原料以及微生物的新陈代谢产物和菌体自溶物[5]。风干后的白酒糟中含有较多的粗纤维（17.0%~21.0%）、粗蛋白（14.0%~22.0%）、淀粉（10.0%~13.0%）和粗脂肪（4%~7%）[6]。近年来，我国在白酒糟的综合利用方面开展了大量研究，主要包括生物发电、有机肥、蛋白饲料和食醋等方面[7-9]。由于我国对蛋白饲料的需求持续增长，而国内大豆、鱼粉等原料来源有限，因此开发非常规饲料资源尤为重要[10]。白酒糟营养结构与蛋白饲料相似，在白酒酿造过程中产生的酵母菌、活性肽、有机酸和一些生物活性因子对动物的消化和生长十分有利[11-12]。混菌固态发酵不仅可以改善酒糟适口性[13]，还可促进动物生长，提高动物免疫力[14]。王炫等[15]以小曲白酒糟为原料生产蛋白饲料，得到的蛋白饲料中粗蛋白含量提高87.5%。司维江等[16]研究表明，混菌发酵可以显著提升白酒糟的营养价值，在基础饲粮中添加50 g/d发酵酒糟饲料（MFFDG）可以有效提升断奶羔羊的生长性能。杨丽华等[17]以白酒酒糟为原料，经发酵处理后，得到酒糟饲料的粗蛋白含量达25.91%，较未经处理的酒糟提高了60.43%。本研究以清香型白酒糟为原料，经混菌发酵，采用正交试验，以粗蛋白含量为指标，探索其生产蛋白饲料的最佳工艺条件，为清香型白酒糟在畜牧生产中的利用提供一定的参考。1材料与方法1.1材料与试剂清香型白酒糟由山西汾阳某酒厂提供，麸皮由茅台镇某酱醋厂提供。枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，编号D）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，编号SY）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum，编号2-41）均为本实验室筛选保藏。牛肉膏、蛋白胨、琼脂粉、酵母膏购自北京奥博星生物技术有限公司，氯化钠、无水碳酸钠、甲基红、溴甲酚绿和次甲基蓝购自天津市科密欧化学试剂有限公司。蔗糖、硼酸、硫酸铵、硫酸钾、五水合硫酸铜（Ⅱ）、氢氧化钠、葡萄糖和乙醇，购自国药集团化学试剂有限公司，浓盐酸和浓硫酸购自昆山金城试剂有限公司。YPD酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（酿酒酵母）[18]，LB牛肉膏蛋白胨培养基（枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌）[18]，混菌种子液培养基[19]。1.2仪器设备GG-17 1 000 mL凯氏定氮装置（康玻玻璃仪器有限公司），FA2204型电子天平（上海菁海仪器有限公司），LDZX-50KBS型立式压力蒸汽灭菌锅（上海申安医疗器械厂），DHG-9140A型电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司），SHP-250型生化培养箱（上海森信实验仪器有限公司），SH220F型石墨消解仪（济南海能仪器股份有限公司），HMB-700S小型研磨式超微粉碎机（弘荃机械企业有限公司），SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台（浙江孚夏医疗科技有限公司），HZQ-C型恒温摇床（常州上特仪器制造有限公司），WP-UP-GHS-30型微量分析型超纯水机（四川沃特尔水处理设备有限公司），KX-C218型通风橱（天长市科信电子有限公司）。1.3试验方法1.3.1菌种活化[20-21]酿酒酵母菌SY：配制YPD斜面培养基，并于121 ℃下灭菌20 min，将酿酒酵母接种到YPD培养基上，放至30 ℃恒温培养箱中培养48 h。枯草芽孢杆菌D：配制LB斜面培养基，并于121 ℃下灭菌20 min，将枯草芽孢杆菌接种到LB培养基上，放至34 ℃恒温培养箱中培养48 h。植物乳杆菌2-41：配制LB斜面培养基，并于121 ℃下灭菌20 min，将植物乳杆菌接种到LB培养基上，放至34 ℃恒温培养箱中培养48 h。1.3.2混菌种子液制备[22-23]将酿酒酵母菌、枯草芽孢杆菌和植物乳杆菌按照菌种比为1∶1∶1，接种到混合种子液培养基上，在30 ℃摇床上培养48 h，当菌种生长量≥1.0×106个/mL时，即可用于酒糟发酵。1.3.3酒糟饲料样液制备准确称取10 g酒糟饲料，放入250 mL烧杯中，加水至溶液体积为100 mL，充分搅拌均匀，用中速滤纸过滤溶液2遍，即可获得澄清透明的酒糟饲料样液，以备细胞计数与酸度检测。1.3.4清香型白酒糟发酵培养基制备[24-25]鲜酒糟经干燥预处理，使其初始水分处于50%~60%之间，使用250 mL的锥形瓶作为发酵容器，按比例添加酒糟和麸皮，总装料量为50 g，调节酒糟发酵培养基酸度。发酵培养基经过121 ℃高温灭菌20 min后，接种枯草芽孢杆菌、酿酒酵母和植物乳杆菌混菌种子液，用玻璃棒充分搅拌均匀，用封口膜和橡皮筋密封，在恒温培养箱中培养。1.3.5水分测定参照GB/T 6435—2014，采用直接干燥法测定水分含量。1.3.6酸度检测采用酸碱滴定法，以NaOH消耗量表示酒醅酸度[26]。1.3.7粗蛋白含量检测参照GBT 6432—2018，采用凯氏定氮法测定粗蛋白含量。1.3.8菌种生长量（活菌和死菌总和）采用显微镜直接计数法测定菌种生长量[27]。1.3.9感官评价本研究根据德国农业协会（Deutsche Lan Dwirtschafts Gesellschaft）评分法[28-29]制定适用本研究所得酒糟饲料的感官评价标准（见表1），通过眼观、鼻闻和手摸的方式对酒糟饲料色泽、气味和质感进行评分，将酒糟饲料分为优良、尚好、中等和腐败4个等级。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.T001表1酒糟饲料感官评价标准项目评分标准分数气味有浓烈的蜜枣香或酒香，发酵特有香气强烈14有蜜枣香、发酵特有香气，香气不浓郁，或有微弱的丁酸臭味10无芳香味儿，丁酸味明显，或有较明显的焦煳味或霉味4有较强的丁酸臭味或氨味，霉味突出2质地原料结构保持良好4原料结构保持较差2原料结构保持极差，或有轻度的霉菌污染1原料腐烂或污染严重0色泽与原料相似，烘干后呈淡褐色2略有变色，褐色较深1变色严重，呈深褐色或黑色0总分16~2010~155~90~4等级优良（1级）尚好（2级）中等（3级）腐败（4级）1.3.10清香型白酒糟发酵培养基配比优化试验分别在麸皮添加量为10%、15%和20%的条件下，研究麸皮添加量对混菌固态发酵饲料质量的影响。种子液的菌种生长量为2.3×106个/mL，混菌接种量为9%，发酵温度为30 ℃，pH值自然，在恒温培养箱中培养4 d。1.3.11清香型白酒糟发酵条件优化单因素试验分别于发酵温度为22、26、30、34、38 ℃的条件下，研究发酵温度对混菌固态发酵饲料质量的影响。种子液的菌种生长量为9.95×106个/mL，麸皮添加量为10%，混菌接种量为9%，pH值为自然条件，在恒温培养箱中培养4 d。分别在接种量为1%、5%、9%、13%和17%的条件下，研究菌种接种量对混菌固态发酵饲料质量的影响。种子液的菌种生长量为9.95×106个/mL，麸皮添加量为10%，发酵温度为30 ℃，pH值为自然条件，在恒温培养箱中培养4 d。分别在发酵时间为2、4、6、8、10 d的条件下，研究发酵时间对混菌固态发酵饲料质量的影响。种子液的菌种生长量为1.72×108个/mL，麸皮添加量为10%，混菌接种量为9%，发酵温度为30 ℃，pH值为自然条件，在恒温培养箱中培养。分别在初始酸度为0.3、0.9、1.5、2.1、2.7 mmol NaOH/10 g的条件下，研究初始酸度对混菌固态发酵饲料质量的影响。种子液的菌种生长量为1.72×108个/mL，麸皮添加量为10%，混菌接种量为9%，发酵温度为30 ℃，在恒温培养箱中培养4 d。1.3.12正交试验根据单因素试验结果，选取接种量（A）、发酵温度（B）、发酵时间（C）和初始酸度（D）4个因素为自变量，以粗蛋白含量为指标，设计4因素3水平正交优化试验方案，正交试验因素水平设计见表2。正交试验所用种子液的菌种生长量为9.03×107个/mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.T002表2正交试验因素水平设计水平A/%B/℃C/dD/(mmol NaOH/10 g)192621.502133040.903173460.301.3.13验证试验在麸皮添加量10%、初始酸度0.90 mmol NaOH/10 g、种子液的菌种生长量9.50×107个/mL、混菌接种量13%和发酵温度26 ℃的条件下，于恒温培养箱中培养6 d。1.4数据统计与分析采用Origin软件作图，试验数据分析使用正交设计助手Ⅱ V3.1专业版。2结果与分析2.1清香型白酒糟初始理化指标的测定结果（见表3）由表3可知，鲜酒糟中水分含量为65.07%，粗蛋白含量为6.55%，酸度为2.16 mmol NaOH/10 g；干酒糟中粗蛋白含量为12.32%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.T003表3清香型白酒糟初始理化指标的测定结果项目鲜酒糟干酒糟水分/%65.07—粗蛋白/%6.5512.32酸度/(mmol NaOH/10 g )2.16—注：“—”表示无相关数据。2.2麸皮添加量对混菌固态发酵饲料质量的影响（见图1）由图1可知，麸皮添加量为10%时，酒糟饲料粗蛋白含量最高，为17.13%，菌种生长量为1.65×107个/g，菌种生长状态良好。麸皮添加量为15%时，两项指标均降低，可能是麸皮中较多的纤维素不利于菌种生长繁殖，故而菌体蛋白含量较低。麸皮添加量为20%时，粗蛋白含量增加，可能是麸皮本身所含蛋白影响所致。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.F001图1麸皮添加量对混菌固态发酵饲料质量的影响2.3清香型白酒糟发酵条件优化单因素试验结果2.3.1发酵温度对混菌固态发酵饲料质量的影响（见图2）由图2可知，混菌固态发酵的最适温度为30 ℃，粗蛋白含量为17.81%，菌种生长量为1.05×108个/g。当温度低于30 ℃时，粗蛋白含量和菌种生长量随着温度升高而增加，这是因为此时发酵温度低于混菌的最适生长温度，在温度升高时，混菌体内的酶活力变强，从而使其生长代谢旺盛，所积累的蛋白含量也增加。而当温度高于30 ℃时，酶活性降低，使细胞的生命活动减弱，粗蛋白含量降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.F002图2发酵温度对混菌固态发酵饲料质量的影响2.3.2菌种接种量对混菌固态发酵饲料质量的影响（见图3）由图3可知，菌种接种量为13%时，粗蛋白含量最高，为18.53%，且菌种生长最旺盛，菌种生长量为2.80×108个/g。随着菌种接种量的增加，两项数值呈升高的趋势，但当接种量达到17%时，菌种数目骤减，可能是由于该接种量下种子液添加量过多，发酵培养基湿度太高，降低了含氧量，不利于菌种生长繁殖，从而使粗蛋白含量变低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.F003图3菌种接种量对混菌固态发酵饲料质量的影响2.3.3发酵时间对混菌固态发酵饲料质量的影响（见图4）由图4可知，发酵时间为4 d时，粗蛋白含量为17.35%，菌种生长量为1.53×108个/g。发酵2 d与4 d差别明显，证明在该阶段内发酵培养基提供的营养物质尚且充分，菌种生长繁殖空间大。而发酵4 d后，菌种数目与蛋白含量不增反降，可能是由于较长时间的发酵，培养基中可利用碳源减少，菌种生长繁殖所需营养成分不足，且细胞处于衰亡期，生命活动减慢，菌体蛋白随着细胞代谢被降解。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.F004图4发酵时间对混菌固态发酵饲料质量的影响2.3.4初始酸度对混菌固态发酵饲料质量的影响（见图5）由图5可知，最适发酵培养基初始酸度为0.9 mmol NaOH/10 g，此时粗蛋白含量最高为19.36%，菌种生长量为1.23×108个/g。当初始酸度在0.3~1.5 mmol NaOH/10 g之间时，酒糟饲料的粗蛋白含量整体较高，菌种生长旺盛。但当初始酸度高于0.9 mmol NaOH/10 g 时，粗蛋白含量随着酸度增加呈下降趋势，表明过于酸性的环境会抑制微生物的生长繁殖，不利于酒糟饲料发酵。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.F005图5初始酸度对混菌固态发酵饲料质量的影响2.4正交试验极差、方差分析结果（见表4、表5）由表4可知，正交试验中试验7所得的粗蛋白含量最高，为24.71%，感官评价等级为优良。由R值可知，4个因素对粗蛋白含量影响大小为CADB，即发酵时间菌种接种量初始酸度发酵温度，与表5中的方差分析结果一致。发酵时间、菌种接种量和初始酸度对粗蛋白含量均具有显著影响（P0.05）。由k值可知，最佳混菌固态发酵工艺条件为A2B1C3D2，即菌种接种量13%、发酵温度26 ℃、发酵时间6 d和初始酸度0.90 mmol NaOH/10 g。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.T004表4正交试验极差分析结果项目ABCD粗蛋白含量/%1111122.262122221.413133323.404212322.585223123.886231224.097313224.718321323.949332121.41k122.35723.18323.43022.517k223.51723.07721.80023.403k323.35322.96723.99723.307R1.1600.2162.1970.886最优组合A2B1C3D210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.T005表5正交试验方差分析结果项目偏差平方和自由度均方F值P值误差0.0770.008A2.36621.183147.870.029B0.07020.0354.380.500C7.80323.901487.630.009D1.42020.71088.750.047注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。正交试验所得酒糟饲料感官形态见图6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.F006图6正交试验所得酒糟饲料感官形态2.5验证试验结果根据正交试验结果得出最优组合为A2B1C3D2，在此混菌固态发酵工艺条件下进行3组平行试验，测得酒糟饲料中粗蛋白含量为（24.97±0.05）%，为正交试验优化后的最佳结果。因此，混菌固态发酵清香型白酒糟制备蛋白饲料的最佳工艺条件为菌种接种量13%、发酵温度26 ℃、发酵时间6 d和初始酸度0.90 mmol NaOH/10 g。验证试验感官评价结果见表6，此条件下得到的蛋白饲料等级为优良。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.015.T006表6验证试验感官评价结果项目色泽质地气味总分等级评价结果得分评价结果得分评价结果得分感官与原料相似，微有变色，烘干后呈褐色，无霉变1原料结构保持良好4蜜枣香和发酵特有香气浓郁1318优良3结论本研究以清香型白酒糟为原料，经烘干处理，使其初始水分在50%~60%之间，添加辅料麸皮，接种枯草芽孢杆菌D、酿酒酵母菌SY和植物乳杆菌2-41，进行混菌固态发酵，生产高品质蛋白饲料。本研究通过探索麸皮添加量对混菌固态发酵饲料质量的影响，优化发酵培养基配比，得出最优酒糟和麸皮比为9∶1，即在酒糟初始水分为50%~60%的条件下，发酵培养基总装料量为50 g，其中清香型白酒糟45 g，麸皮5 g。本研究在单因素试验的基础上，以粗蛋白含量、菌种生长量和感官评价为指标，采用正交试验优化混菌固态发酵清香型白酒糟制蛋白饲料工艺条件，得出最优工艺条件为菌种接种量13%、发酵温度26 ℃、发酵时间6 d和初始酸度0.90 mmol NaOH/10 g。在此条件下进行3组平行试验，得到的蛋白饲料中粗蛋白含量为（24.97±0.05）%，感官评价得分为18分，感官评价等级为优良。