地西泮属于苯二氮䓬类镇静剂，又名安定。作为兽用药，地西泮的主要功效为镇静催眠和促生长，在水产品养殖过程中，水产饲料中添加地西泮药物可以使机体内的代谢速率下降，提升机体质量，进一步增加水产品产量和效益[1]。但地西泮在水产品中残留后可通过食物链进入人体，严重威胁人体健康。我国规定禁止在各种动物的饲料中加入地西泮等药物[2]。目前，常采用酶联免疫吸附法（ELISA）、高效液相色谱法（HPLC）、气相色谱-串联质谱法（GC-MS/MS）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等方法检测地西泮等药物[3-5]。《饲料中盐酸异丙嗪、盐酸氯丙嗪、地西泮、盐酸硫利达嗪和奋乃静的同步测定 高效液相色谱法和液相色谱质谱联用法》（NY/T 1458—2007）中提取步骤较复杂，方法的检出限较高，而且该方法属于外标方法，没有经过内标进行矫正，可能会使结果的准确度降低[6]。因此，本研究采用直接通过型SPE柱的前处理手段建立一种快速检测地西泮的方法，为促进水产养殖行业的健康发展提供参考。1材料与方法1.1仪器与材料试验仪器：1290-6470B超高效液相色谱串联质谱仪（美国安捷伦公司）、涡旋仪（美国Millipore公司）、精密电子天平（梅特勒-托利多称重设备系统有限公司）、Milli-Q超纯水机（美国Millipore公司）。试验材料：地西泮及地西泮-D5标准品（100 mg/L，天津阿尔塔科技有限公司）、甲酸（质谱纯，美国Thermo Fisher公司）、乙腈（色谱纯，美国Thermo Fisher公司）、异辛烷（色谱纯，北京迪马科技有限公司）、Clean-up column-LPAS净化柱（北京科德诺思技术有限公司）。其他未做说明的化学试剂均为分析纯（天津福晨试剂有限公司），试验用水为超纯水，水产饲料购自河北省唐山市。1.2试验方法1.2.1标准中间溶液配制移取适量地西泮标准品（100 mg/L）至10 mL棕色容量瓶，用甲醇稀释定容至刻度，配制成10.0 mg/L的地西泮标准中间液，有效期3个月。移取适量地西泮-D5标准品，用甲醇稀释，定容至刻度，配制成10.0 mg/L的地西泮标准中间液，有效期3个月。1.2.2标准工作溶液配制取适量地西泮标准中间液和内标中间液，用空白基质提取液依次稀释浓度为1.0、2.0、5.0、8.0、10.0 μg/L的标准物质工作液。1.2.3样品前处理将样品粉碎后，用天平称取2.0 g，放入离心管中，添加内标液100 μL和10 mL的乙腈-甲酸水溶液（体积比8∶2），用旋涡仪搅拌10 min，超声5 min，4 000 r/min离心10 min，取上清液5 mL于50 mL离心管中，加入5 mL异辛烷，轻微振荡30 s，8 000 r/min离心5 min，弃异辛烷层，反复步骤1次，得到初步净化的提取液。取2 mL提取液，过直接通过型SPE交换固相萃取柱，收集滤液，混匀，用滤膜过滤。1.2.4仪器条件（1）色谱条件。色谱柱为Waters HSS T3（5.0 mm×2.1 mm，1.7 μm），柱温40 ℃，进样量为5 μL；流动相：5 mmol/L乙酸铵+0.1%甲酸水溶液（A）+乙腈（B）；梯度洗脱：0~0.6 min，90% A+10% B；0.6~1.2 min，80% A+20% B，1.3~2.2 min，80% A+20% B，2.3~3.0 min，90% A+10% B；流速：0.4 mL/min。（2）质谱条件。离子源：电喷雾（ESI）离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；干燥气温度：300 ℃；喷嘴电压：500 V；毛细管电压：3 500 V；鞘气流速：11 L/min。地西泮及其内标物MRM采集参数见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.T001表1地西泮及其内标物MRM采集参数项目母离子质荷比子离子质荷比碰撞能量/eV去簇电压/V地西泮285.2193.1*，153.935，20160地西泮-D5290.1197.0*35160注：“*”为定量离子。2结果与分析2.1专属性结果本试验使用两种方法对LC-MS/MS方法的专属性进行考察。饲料空白基质、空白加标和标准品色谱图见图1。由图1可知，该目标物的溶剂峰对目标峰没有影响。分析3个不同来源的饲料样品，与只添加标液的色谱图对比，在其中加入地西泮标液的提取物色谱图的结果为饲料基质中不存在干扰定性和（或）定量的物质。图1饲料空白基质、空白加标和标准品色谱图10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.F1a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.F1a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.F1a32.2检测限（LOD）和定量限（LOQ）结果添加适量地西泮标准溶液于空白试样中，使空白添加样品的含量为一定值，经提取处理后供液相色谱-串联质谱仪检测，依据药物信噪比S/N3（按PtP算），确定地西泮在水产饲料中的检测限。添加适量地西泮标准溶液于空白试样中，使空白添加样品的含量为另一定值，经提取处理后供液相色谱-串联质谱仪检测，依据药物信噪比S/N10（按PtP算），确定地西泮在水产饲料中的定量限[7-8]。本研究通过测定添加一定浓度的地西泮空白饲料样品，确定了本研究地西泮在渔用饲料中的检测限为0.3 μg/kg，定量限为1.0 μg/kg。2.3标准曲线的绘制结果以待测物定量离子质量色谱峰面积与相应内标的定量离子质量色谱峰面积的比作为纵坐标，溶液的浓度作为横坐标，制成标准曲线，计算相应数据[9]。地西泮标准曲线见图2。由图2可知，地西泮在1.0~10.0 µg/L范围内线性良好，相关系数为0.999 7，满足方法检测要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.F002图2地西泮标准曲线2.4基质效应结果采用UPLC-MS/MS的ESI离子源时，基质中的杂质会影响目标化合物的离子化程度，从而在色谱图上表现出比标准品色谱图增强或减弱的形式图谱，即为样品的基质效应（ME）。基质效应普遍存在于兽药残留分析的液质检测方法中，影响目标化合物的准确定量，因此必须采取相应的手段来减少样品的基质效应[10-12]。按照1.2.3中样品前处理方法制备空白基质提取液。取适量地西泮标准中间液，用空白基质提取液依次稀释成浓度为1、2、5、8、10 µg/L的基质匹配标准曲线，用UPLC-MS/MS检测。同时，使用同浓度系列的地西泮标准工作溶液配制成标准工作曲线。基质标准溶液斜率与溶剂标准溶液斜率的差值除以溶剂标准溶液的斜率，所得结果即为样品的ME。基质效应判定方法见表2[13-15]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.T002表2基质效应判定方法ME范围结果0≤|ME|≤20％基质对信号干扰较弱，可判定为无基质效应20％＜|ME|＜50％中等强度基质效应干扰|ME|≥50％强基质效应干扰经计算，地西泮在水产饲料中的ME为73.2%，基质效应较强。为准确定量，本研究采用同位素稀释法有效消除基质效应的影响，减少样品前处理过程中人为引入的误差，提高方法的准确性和重现性。2.5不同SPE柱定量结果本研究采用了HLB柱、C18柱和Clean-up column-LPAS直接通过型净化柱检测水产饲料中地西泮的回收率，结果见图3。由图3可知，采用HLB柱回收率为77.8%~94.1%，采用C18柱回收率为69.6%~87.5%，采用Clean-up column-LPAS直接通过型净化柱回收率为82.9%~107.1%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.F003图3HLB柱、C18柱和Clean-up column-LPAS柱回收率2.6准确度和精密度回收率可以衡量方法的准确度，变异系数可衡量方法的精密度。本研究做了高浓度、中间浓度和低浓度3个点的质控样，低浓度选择定量限，中、高浓度选择2倍定量限和5倍定量限。在饲料中添加1.0、2.0、5.0 µg/kg共3个浓度的地西泮样品，每个浓度6个样品，在不同日期连续制备并测定3个分析批，计算其回收率和批内、批间的变异系数，结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.022.T003表3水产饲料中地西泮的添加回收率、批内和批间精密度添加浓度/(μg/kg)测定批次回收率/%平均回收率/%批内RSD/%批间RSD/%1234561.0Ⅰ94.593.098.693.797.795.295.52.14.6Ⅱ96.786.998.588.687.897.392.65.3Ⅲ99.8101.4100.791.9100.9100.499.23.32.0Ⅰ90.084.392.384.483.690.687.54.05.7Ⅱ94.782.695.386.387.195.990.35.7Ⅲ99.393.797.196.985.984.392.96.25.0Ⅰ90.790.388.090.791.987.489.81.83.4Ⅱ87.996.887.494.995.687.991.84.4Ⅲ90.091.789.798.191.095.392.63.3由表3可知，地西泮在低、中、高3个水平添加量下，回收率为82.6%~101.4%，批内RSD为1.8%~6.2%，批间RSD为3.4%~5.7%，均满足检测方法要求。2.7实际样品检测结果用本研究建立的检测方法在两个月内共检测水产饲料样品136批，其中检出地西泮饲料3批，均在本方法定量限以下，检测限以上，故没有准确定量。因地西泮在饲料中不得检出，本方法检出的3批样品已交由相关执法部门继续确证和跟进。3讨论3.1提取试剂的优化分析本研究采用兽药残留分析提取的一般过程，分别采用乙腈、甲醇、乙酸乙酯进行提取，发现采用乙腈提取时，样品的提取和净化状态最佳。本研究分别对比了通过加入碱和酸调节溶液的pH值来检验提取效率，发现用乙腈作为提取液的同时加入2 mL的甲酸水溶液，可大大提高提取效率。研究对0.1%、0.2%、0.5%、1.0%共4种不同浓度的甲酸水溶液进行了研究，发现酸性过高对提取效果有负面影响，经过多次试验，最终确定了加入甲酸水的浓度为0.2%[16-17]。在饲料样品除脂溶剂的选择上，本研究对比了正庚烷、正己烷和异辛烷3种试剂，从样品除脂程度、乳化程度和仪器测定后杂峰的表现等方面综合考虑，选择了表现最好的异辛烷作为本方法的除脂溶剂[18]。3.2净化方式的优化分析在实际检测过程中，水产饲料基质复杂，成分多样，一般含有大量碳水化合物、蛋白质、维生素、脂肪以及色素等较多的干扰杂质[19-20]。提取液尽管采用了除脂溶剂进行除脂，但在净化过程中仍含有脂肪、色素等大分子杂质。净化不完全会造成提取液浑浊，影响仪器寿命[21]。常用的净化方式有液-液分配法（液-液萃取）、固-液净化法（固相萃取柱净化）和QuEChERS净化法等[22-24]。本研究采用乙腈作为提取剂，由于乙腈与大部分有机溶剂均能够很好地互溶，因此液-液分配法很难实现[25]。参考现行有效的标准方法，固相萃取净化法非常成熟，但步骤烦琐，影响时效。QuEChERS净化法是通过向提取液中添加吸附材料达到净化效果，如N-丙基乙二胺（PSA）、C18、硅酸镁等，缺点是QuEChERS净化法对含水量低、脂肪含量高的试样净化效果不理想，净化损失大[26]。本研究选择了针对饲料基质定制的直接通过型SPE固相萃取柱，经过提取后的饲料样品可直接进行上样净化，除脂效果好，净化结果能够满足方法要求，大大提高了检测效率。3.3SPE固相萃取柱的优化分析SPE是基于液-固相色谱理论，采用目标性、选择性地吸附目标物、选择性洗脱杂质的方式对所处理样品中的残留目标物进行富集和净化的过程，其本质属于物理萃取过程。固相萃取主要目的在于净化样品，降低样品基质干扰，提高方法检测灵敏度，已广泛应用于兽药残留检测工作[27]。本研究中，采用Clean-up column-LPAS柱回收率最高。这是因为pH值对聚合物基质的HLB小柱的耐受性、亲水性、耐干涸性能、粒径、比表面等技术参数优于硅胶建合的C18，因此采用HLB固相萃取的回收率比C18柱的回收率高[28]。分析HLB柱和Clean-up column-LPAS直接通过型净化柱的回收率结果，发现二者均可满足检测要求。但HLB柱需要活化、上样、淋洗和洗脱等步骤，较为烦琐；而Clean-up column-LPAS直接通过型净化柱操作简单，节省试剂和时间等成本，可以用于水产饲料中地西泮的大量样本测定。3.4色谱柱的选择和优化分析本研究对Hypersil GOLD C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）、Waters HSS T3（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Acclaim TM C8（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）3款色谱柱进行测试。结果表明，使用C8色谱柱时，地西泮的出峰时间晚于使用C18柱。这是因为C18比C8的碳链更长，保留特性更好，C18色谱柱更适用于分析分子量较小的物质，而C8柱更适合分析分子量大的物质，如球蛋白等，因此C18填料更适合地西泮的分离[29]。而T3色谱柱是极性较强的反相色谱柱，本质上是在C18键合相基础上又加上极性基团修饰，因此比单独C18柱更能耐受高比例水相[25]。T3色谱柱基体采用聚合物（单体为四乙氧基硅氧烷）杂化颗粒得到的纯度极高的合成硅胶，对低pH值的耐受性得到增强；采用低密度封端技术可以兼容100%纯水相作为流动相，且键合相抗流失能力强，显著增强了对极性分子的反相保留能力。因此，本研究最终采用了Waters HSS T3色谱柱。3.5质谱条件的优化分析本研究采用同位素稀释法进行定量，选用DAP-D5作为地西泮的内标物。考察质谱条件时，将大浓度的标准溶液和内标溶液通过三重四极杆质谱进行一级全扫描，在正、负离子扫描模式下，通过调节碰撞气的大小，确认目标化合物的母离子在两种扫描模式下是否稳定，确认母离子质荷比后进行二级质谱的参数优化[30]。在主要参考地西泮相关国家标准和文献中记录的离子对的前提下[31]，通过调节碰撞能量、鞘气和辅助气等参数对碎裂后的离子碎片进行筛选，对照国家标准选取响应值最大且稳定的碎片离子作为定量离子，选取响应值较大的碎片离子作为定性离子。结果发现，地西泮在[M+H]+模式下具有最强的响应值，最终确定质谱条件。4结论本研究在固相萃取法基础上采用直接通过式固相萃取的方式对样品进行前处理操作，参考NY/T 1458—2007，以内标法为基础，采用超高效液相色谱-串联质谱（UHPLC-MS/MS）测定水产饲料中的地西泮，并对样品提取、净化和仪器操作条件进行比较和优化，为水产品饲料中地西泮残留监测和风险评估提供有效的技术手段。