我国已禁止在饲料中添加饲用促生长类抗生素，无抗养殖成为畜禽养殖业发展的趋势，关于抗生素替代物的研究及应用成为行业关注的热点[1]。中药具有来源广泛、不易产生耐药性、能够增强机体免疫力等优点[2]。中药活性成分具有镇痛、抗炎、调节免疫活性、调节肠道菌群的功能[3-4]。《本草纲目》中记载：山药益肾气、健脾胃、止泻痢、化痰、润皮毛，具有补脾养胃、生津益肺、补肾涩精之功效[5]。山药中含有淀粉、氨基酸、非淀粉多糖、维生素等多种营养物质。其中山药多糖是山药的主要功效成分之一，具有缓解机体氧化应激[6]、抗炎[7]、增强免疫力[8]和抑菌[9]等多种生物活性。在动物饲粮中添加适量的山药多糖能够改善机体的免疫能力[10]。YANG等[11]研究发现，山药多糖具有较强的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基的能力。于莲等[12]研究发现，山药多糖对肠道微生态失调大鼠的肠道健康具有明显的改善作用。但山药多糖在犊牛生产中的应用尚未见报道。因此，本试验旨在研究山药多糖对犊牛免疫功能、抗氧化能力和肠道菌群的影响，为山药多糖在犊牛生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料选取36头（30±3）d、体重为（55.27±1.53）kg、健康状况良好的犊牛。山药多糖（50%）购自西安瑞盈生物科技有限公司；代乳粉购自Schils B.V集团。ELISA试剂盒购自上海江莱生物科技有限公司。1.2试验设计犊牛随机分为2组，对照组（CG组）饲喂代乳粉5 L/(头·d)，试验组（EG组）饲喂含10 g山药多糖的代乳粉5 L/(头·d)。试验期10 d。代乳粉和开食料营养水平见表1和表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.T001表1代乳粉营养水平项目粗蛋白水分粗脂肪粗灰分粗纤维乳糖含量22.05.016.09.50.346.0%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.T002表2开食料营养水平项目粗蛋白干物质粗脂肪粗灰分中性洗涤纤维酸性洗涤纤维钙磷含量20.3190.347.854.1130.919.531.370.69注：开食料为嘉吉饲料的普瑞纳1116。%1.3饲养管理试验在河北邢台某牧业集团进行，所有栏舍在试验开始前进行清洗和消毒，免疫程序按照牛场常规方法进行。犊牛每日8：30和19：30饲喂，试验期间自由采食和饮水。1.4测定指标及方法1.4.1血清免疫指标试验第10 d晨饲前，对犊牛进行颈静脉采血10 mL，3 500 r/min离心10 min，取上层血清于-20 ℃保存，用于测定犊牛血清免疫指标。检测项目包括血清免疫球蛋白A（IgA）、免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白细胞介素-2（IL-2）、白细胞介素-6（IL-6）及肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等指标。1.4.2血清抗氧化指标使用1.4.1采集的血清测定犊牛抗氧化指标。检测项目包括血清谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）及丙二醛（MDA）等指标。1.4.3肠道微生物菌群试验第10 d晨饲前，采集犊牛直肠内容物约5 g，置于冻存管内-80 ℃保存，用于肠道菌群检测。使用NovaSeq 6000（Illumina，San Diego，USA）进行上机测序，采用CTAB方法对样本的基因组DNA进行提取，根据Barcode序列和PCR扩增引物序列从下机数据中拆分出各样本数据，正向引物为515F 5'-CCTAYGGGRB GCASCAG-3'，反向引物为806R 5'-GGACTACNNG GGTATCTAAT-3'，扩增微生物16S rDNA基因的V4区域，对样本进行检测测序。研究两组犊牛肠道菌群群落构成情况，通过OTUs分析、Alpha分析及Bata分析判断犊牛肠道菌群是否发生改变，通过不同分类水平上分析判断肠道菌群群落结构是否发生变化，通过LEFSe分析检测存在显著差异的群落。1.5数据统计与分析采用Excel软件对各组数据进行统计整理，SPSS 20.0软件进行统计分析，使用独立样本t检验对试验数据进行显著性分析。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1山药多糖对犊牛血清免疫指标的影响（见表3）由表3可知，与CG组相比，EG组犊牛血清中IgA、IgG、IgM和TNF-α含量显著增高（P0.05），IL-2和IL-6的含量分别提高了18.79%和6.90%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.T003表3山药多糖对犊牛血清免疫指标的影响项目IL-2/(ng/L)IL-6/(ng/L)IgA/(mg/L)IgG/(g/L)IgM/(mg/L)TNF-α/(ng/L)P值0.0640.3130.0040.0230.0110.036CG组1 036.57±105.16148.36±10.442 073.56±59.06b5.91±0.09b1 245.63±107.58b152.34±5.65bEG组1 231.39±61.14158.59±11.272 482.91±49.36a6.57±0.37a1 714.27±135.75a174.73±9.64a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2山药多糖对犊牛血清抗氧化指标的影响（见表4）由表4可知，与CG组相比，EG组犊牛血清SOD活性显著增高（P0.05），GSH-Px活性增高了18.00%（P0.05），MDA含量降低了22.18%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.T004表4山药多糖对犊牛血清抗氧化指标的影响项目SOD/(U/mL)MDA/(μmol/L)GSH-Px/(U/mL)P值0.0030.1200.391CG组5.81±0.12b5.77±0.67504.96±71.64EG组8.17±0.33a4.49±0.88595.84±139.842.3犊牛肠道菌群多样性分析（见图1、表5、图2）由图1可知，在CG组和EG组犊牛粪便提取的DNA分别获得了1 124和1 903个OTUs，两组共有的OTUs是486个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F001图1样品OTUs韦恩图由表5可知，EG组的Chao1指数、Shannon指数和OTUs个数均高于CG组，两组覆盖率相等，说明添加山药多糖后犊牛肠道菌群群落样品总数增多，群落中物种的丰富度和均匀度更好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.T005表5样本多样性指数组别Chao1指数Shannon指数覆盖度指数OTUs/个CG组586.5646.4670.999581.667EG组815.9986.8410.999796.333采用PCA和NMDS方法分析犊牛肠道菌群Bata多样性的差异，分析样本间群落组成的相似度，结果见图2。图2Beta多样性分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F2a1（a）PCA分析 （b） NMDS分析由图2（a）可知，PC1和PC2两个主成分的贡献率分别为35.75%和21.63%，EG组几乎可以覆盖CG组。由图2（b）可知，CG组样本距离相近，表明微生物群落结构相似，EG组样本之间距离远，表明微生物群落结构组内相似度小，群落之间存在差异。由图2可知，与EG组相比，CG组样本分布较为集中，且CG组和EG组各组均能形成聚类簇，可以很好地区分，表明所采样品的重复性较好。2.4不同分类水平上肠道菌群群落结构分析（见图3、图4）由图3可知，相对丰度较大的菌门主要包括：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidote）、变形菌门（Proteobacteria）等，占菌群分类的90%以上，在CG组中占比分别为53.49%、37.79%、6.39%，在EG组中占比分别为65.08%、21.89%和10.27%。与CG组相比，EG组的厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteriota）相对丰度分别提高了21.67%、60.83%、88.25%。与CG组相比，EG组的拟杆菌门（Bacteroidote）相对丰度显著降低（P0.05），梭杆菌门（Fusobacteriota）相对丰度降低了70.83%。图3门水平上物种差异分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F3a1（a）门水平上物种相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F3a2（b）门水平上t-test组间物种差异分析由图4可知，在科水平上，各组相对丰度较大的有普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）、瘤胃球菌科（Ruminococcaceae）、拟杆菌科（Bacteroidaceae）、颤螺旋菌科（Oscillospiraceae）和毛螺菌科（Lachnospiraceae），在CG组中的相对丰度分别为15.01%、12.82%、18.59%、8.94%和11.92%，在EG组中的相对丰度分别为7.33%、17.36%、10.08%、12.78%和12.31%。与CG组相比，EG组的巴斯德杆菌科（Pasteurellaceae）增高。图4科水平上物种差异分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F4a1（a）科水平上物种相对丰度10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F4a2（b）科水平上t-test组间物种差异分析2.5LEfSe分析（见图5）由图5可知，根据LDA值＞2.5，EG组有梭菌纲（Clostridia）、消化链球菌属（Peptostreptococcus）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）等有益菌，CG组仅有毛螺菌科（Lachnospiraceae）一种有益菌，说明EG组肠道菌群结构更具有多样性且有益菌丰度更大。图5各组物种LDA值分布和物种分类学分枝10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F5a1（a）各组物种LDA值分布10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.001.F5a2（b）各组物种分类学3讨论3.1山药多糖对犊牛血清免疫指标的影响中药多糖可以直接促进免疫器官和免疫细胞的生长，并通过与免疫细胞表面的受体结合，激活多种信号通路，调节机体促炎因子、抗炎因子和趋化因子水平，进而调节免疫系统[13]。免疫球蛋白由淋巴细胞和浆细胞分泌产生，主要包括IgG、IgM、IgA，是反映机体免疫功能的重要指标[14]。细胞因子IL-2与IL-6均可促进B淋巴细胞和T淋巴细胞的增殖分化，促进机体免疫应答[15]。TNF-α等细胞免疫因子是一类高活性、多功能的多肽或蛋白质，可作为细胞间的信号传递分子，并调节炎症反应，在细胞间相互作用以及炎症过程中起到重要的调节作用[16]。郑梦荷等[17]研究表明，饲粮中添加10 g/d枸杞多糖可显著提高犊牛血清IgA和IL-6的含量。赵伟鑫等[18]研究表明，在基础饲粮中添加0.10%的山药多糖可显著提高仔猪血清干扰素-γ（IFN-γ）、IL-2、IgG和IgM的含量，表明山药多糖在一定程度上可诱导免疫因子的产生，增强机体的免疫功能。本研究表明，在犊牛代乳粉中添加山药多糖提高了犊牛血清中IgG、IgA、IgM、TNF-α、IL-6和IL-2的含量，说明在犊牛代乳粉中添加山药多糖可以调节犊牛机体的免疫系统，提高犊牛的抗病力。3.2山药多糖对犊牛血清抗氧化功能的影响动物机体的抗氧化系统维持机体自由基产生和清除之间的动态平衡，该平衡状态和动物机体的健康密切相关[19]。SOD是机体内抗氧化系统的第一道防御屏障，其活性可反映机体清除自由基的水平[20]。GSH-Px具有抵抗机体氧化损伤的作用，是细胞防御的重要组成部分[21]。MDA可衡量氧化应激的损伤程度，其水平可反映体内氧自由基的水平。动物机体处于严重的氧化应激时，机体产生的氧自由基增多，会影响机体DNA、蛋白质的代谢，导致脂质氧化物MDA含量增多，对机体健康极为不利[22]。中药多糖具有增强机体抗氧化酶活性、有效清除自由基的功能[23]。张华等[24]研究发现，在育肥猪饲粮中添加0.15%黄芪多糖可显著提高血清GSH-Px活性，降低MDA含量。宋丽霞等[25]研究表明，沙葱多糖可显著提高肉羊血清T-SOD和GSH-Px的活性，降低血清MDA含量，提高肉羊肝脏的抗氧化能力。赵伟鑫[26]在饲粮中添加不同浓度的山药多糖，发现肉鸡血清总抗氧化能力及T-SOD、GSH-Px、谷胱甘肽S转移酶活性均高于对照组，且MDA含量低于对照组，尤其0.05%山药多糖组效果最为显著。本研究表明，添加山药多糖可显著提高犊牛血清中SOD、GSH-Px活性，降低犊牛血清中MDA含量，说明在代乳粉中添加山药多糖可提高犊牛机体的抗氧化能力。3.3山药多糖对犊牛肠道菌群的影响中药多糖可调节畜禽肠道的菌群结构[27]。山药多糖可逆转肠道微生物群紊乱，改善肠道健康[28]。葛根多糖可增加小鼠肠道有益菌丰度，恢复小鼠肠道生态系统平衡[29]。厚壁菌门有助于纤维素的消化，肠道中丰富的厚壁菌门有助于满足动物在生长发育过程中的能量和营养需求[30]。变形菌门能够产生脂多糖，脂多糖可以增加后肠道的通透性，变形菌门通过消耗氧气，为厌氧菌持续在肠道菌群中定植起重要作用[31]。放线菌门是细菌中的一个重要类群，因菌落呈放线状而得名，比其他菌群具有更丰富的生物活性物质资源，可以利用不同的碳水化合物作为能源[32]。梭杆菌门是常见的机会性致病菌，与新生仔猪的腹泻和肠炎等疾病有关[31]。本研究对样本肠道菌群进行门水平上的群落结构分析，结果显示，添加山药多糖后，犊牛肠道厚壁菌门、变形菌门和放线菌门相对丰度均增加，梭杆菌门相对丰度减少。瘤胃球菌科是厚壁菌门代表性的物种，具有降解抗性多糖的物质，还可提供一系列酶降解系统[33]。毛螺菌科包含毛螺菌属、丁酸弧菌属、罗氏菌属等细菌，该菌科具有降解毒素、抵制致病菌感染的作用[34]，可产生短链脂肪酸，将初级胆汁酸转化为次级胆汁酸，并通过促进对肠道病原体的定植抗性而影响宿主[35]。本研究对样本肠道菌群进行科水平上的群落结构分析，结果显示，添加山药多糖后，犊牛肠道瘤胃球菌科和毛螺菌科占比增多。梭菌纲包含许多肠道共生菌，包含高度多样化的物种，其中许多物种可产生短链脂肪酸，促进机体能量代谢。消化链球菌有助于食物的消化吸收，从而产生机体所需的维生素，调节免疫力，促进机体健康生长[36]。瘤胃球菌属是厚壁菌门中丰度最高的物种，也是牛肠道中最具代表性的物种，属于典型的纤维降解菌，其中大部分可降解蛋白质，帮助食物在胃肠道中分解消化，有助于机体生长发育[37]。本研究对样本肠道菌群进行LEfSe分析，结果显示，添加山药多糖后，在犊牛肠道中起主要作用的是梭菌纲、消化链球菌属、瘤胃球菌属等有益菌。本研究结果表明，添加山药多糖可以增加犊牛肠道菌群丰度，增加有益菌比例，改善犊牛肠道菌群结构。4结论本研究结果表明，代乳粉中添加10 g/(头·d)的山药多糖能够提高犊牛血清免疫功能和抗氧化功能，通过增加肠道菌群有益菌丰度，减少致病菌数量，从而调节犊牛肠道菌群。