牦牛是生活在青藏高原的特有牛种，能够适应低温、低氧的生活环境[1]。饲粮组成和营养水平对牦牛瘤胃微生物的影响是近年来的研究热点[2-3]。但青藏高原地区存在牧草生长期短、过度放牧、草场严重退化等问题，使牦牛在传统放牧的饲养管理下长期处于营养匮乏状态。在实际生产中，牦牛冷季舍饲得到了较好的饲养效果。姚喜喜等[4]探究不同饲养方式对牦牛生长性能、瘤胃发酵参数等方面的影响时发现，与传统放牧相比，冷季舍饲不仅改善了牦牛的瘤胃发酵功能，还极大地提高了牦牛的生长性能和屠宰性能。而牦牛从放牧到舍饲、高粗料到高精料的转换中，其胃肠道的菌群也会发生相应动态变化，进而影响牦牛的生产性能。因此，探究牦牛生产中饲粮精粗比的转换具有重要意义。目前对牦牛瘤胃菌群的研究较多，而对其粪便细菌的相关研究较少。如戴东文等[5]指出，合理提高饲粮精粗比有利于暖季放牧牦牛的瘤胃发酵，使瘤胃部分淀粉降解菌的相对丰度有所增加，从而提高牦牛的生长性能。牦牛的后肠道内含有丰富的益生菌群，能够促进短链脂肪酸（SCFA）的合成，提高饲料的转化率[6]。反刍动物后肠菌群对机体营养物质的消化吸收起到重要作用，能够在一定程度上反映宿主的消化功能。通过试验分析粪便菌群可以在一定程度上反映肠道菌群的结构。因此，在饲粮精粗比转换条件下，了解牦牛粪便菌群动态变化具有重要意义。本研究主要通过16S rRNA测序技术，对比分析饲粮精粗比转换的条件下，牦牛粪便菌群的分布、相对丰度及功能预测的变化，为牦牛的合理饲养提供参考。1材料与方法1.1试验设计与饲养管理试验从青海省海南藏族自治州贵南县老扎西养殖场选取24头3周岁公牦牛，其体重为（246.43±14.85）kg、体况健康良好。1~60 d饲喂饲粮精粗比30∶70（C30组），61~120 d转换为精粗比70∶30（C70组）。预试期15 d，正式试验期120 d。按《肉牛饲养标准》（NY/T 815—2004）配制饲粮[7]。试验饲粮组成及营养水平见表1。试验前，对所有牦牛进行驱虫并统一编号，单栏饲养。试验期间，保持相同的饲喂环境，自由饮水，保证牦牛第2 d饲喂前有剩余料草，每天8：00和17：00进行饲喂。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.T001表1试验饲粮组成及营养水平项目C30组C70组原料组成/%燕麦干草70.0030.00玉米13.6131.65小麦3.738.87麸皮4.029.02菜籽粕3.818.71豆粕1.203.40棕榈油脂肪粉1.232.75磷酸氢钙0.601.40食盐0.601.40预混料1.202.80合计100.00100.00营养水平代谢能/(MJ/kg)9.7612.15粗蛋白/%11.0513.23中性洗涤纤维/%45.2429.10酸性洗涤纤维/%29.4115.84钙/%0.420.47注：1.棕榈油脂肪粉能量为27.42 MJ/kg，数值参考NRC（2106）计算[8]。2.预混料为每千克饲粮提供：Cu 10 mg、Fe 65 mg、Mn 30 mg、Zn 25 mg、I 0.5 mg、Co 0.1 mg、VA 4 000 IU、VD 500 IU、VE 40 IU。3.营养水平中代谢能为计算值，其余均为实测值。1.2测定指标及方法1.2.1样品采集试验第60 d和120 d，饲喂3~4 h后随机选取6头试验牦牛，采用直肠粪便采样法收集约50 g粪便，分装于两个5 mL的无菌冻存管，液氮保存，用于后续测定微生物区系。1.2.2DNA提取、PCR扩增及测序粪便样本利用CTAB法获取微生物DNA，采用1.0%琼脂糖凝胶电泳评估DNA的质量；利用特异性引物515F（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）和806R（5'-GTGCCAGCMGCCGCGG-3'）进行PCR扩增，并对获得的产物进行测定、纯化及构建文库；通过Qubit和Q-PCR对文库进行定量分析，在Illumina NovaSeq6000平台上进行测序。整个流程由奥维森科技有限公司（北京）完成。1.3数据统计与分析试验数据经Excel软件处理，采用SPSS 26.0软件中One-way ANOVA分析统计学差异。结果由平均值和标准误差（SEM）表示，P0.01表示差异极显著，P0.05表示差异显著。采用线性判别分析效应量（LEfSe，LDA3）[9-10]评价组间差异物种。2结果与分析2.1饲粮精粗比转换对牦牛粪便菌群OTU分布的影响（见图1）由图1可知，2组共获得1 466个OTU，其中C30组和C70组分别检测到1 308和1 295个OTU，相对特有的OTU数目分别为171和158个，共有OTU数目为1 137个，占总OTU数目的77.56%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.F001图1牦粪便菌群Venn图2.2饲粮精粗比转换对牦牛粪便菌群丰度与多样性的影响（见图2、表2、图3）由图2可知，随着测序深度的增加，两组的粪便菌群物种稀释曲线逐渐趋于平缓，测序程度基本覆盖到样本中所有的细菌物种，表明微生物群落反映准确。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.F002图2牦牛粪便菌群物种稀释曲线由表2可知，两组菌群的谱系多样性及多样性指数（Chao1指数、Simpson指数、Shannon指数）差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.T002表2饲粮精粗比转换对牦牛粪便菌群α多样性的影响项目Chao1指数Shannon指数Simpson指数谱系多样性C30组966.016.800.9756.54C70组947.116.810.9753.82SEM31.090.080.001.34P值0.780.960.180.33由图3可知，两组牦牛的粪便菌群结构的差异性明显。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.F003图3C30组和C70组PCoA结果2.3饲粮精粗比转换对牦牛粪便菌群组成的影响（见表3、表4、图4、图5）由表3可知，牦牛粪便中优势菌门为放线菌门（Actinobacteriota）、厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidota）、螺旋体门（Spirochaetota）和髌细菌门（Patescibacteria）。对比分析差异性可知，C70组中放线菌门相对丰度显著高于C30组（P0.05），两组的其他优势菌门的丰富度也存在一定的差异（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.T003表3饲粮精粗比对牦牛粪便门水平菌群组成的影响项目放线菌门厚壁菌门拟杆菌门螺旋体门髌细菌门C30组0.091b0.7330.1480.0090.010C70组0.120a0.7620.1950.0130.006SEM0.0170.0240.0220.0030.002P值0.0240.5790.3010.4780.251注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），无字母表示差异不显著（P0.05）。由表4可知，牦牛粪便中优势菌属为克里斯藤森菌科_R-7群（Christensenellaceae_R-7_group）、毛螺旋菌属_NK3A20_群（Lachnospiraceae_NK3A20_group）、狭义梭菌属（Clostridium_sensu_stricto_1）、理研菌属（Rikenellaceae_RC9_gut_group）、罗姆布茨菌属（Romboutsia）、UCG-005、未培养菌属、未培养杆菌属（uncultured_bacterium）、未分类菌属、拟杆菌属（Bacteroides）、罗氏菌属（Roseburia）、螺旋杆菌（Turicibacter）、丁酸弧菌属（Acetitomaculum）、欧陆森氏菌属（Olsenella）、索氏梭菌属（Paeniclostridium）。对比差异性分析可知，C70组中未分类菌属的相对丰度极显著高于C30组（P0.01），未培养杆菌属和罗氏菌属的相对丰度显著高于C30组（P0.05），毛螺旋菌属_NK3A20_群、欧陆森氏菌属、索氏梭菌属的相对丰度显著低于C30组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.T004表4饲粮精粗比对牦牛粪便属水平菌群组成的影响项目C30组C70组SEMP值克里斯藤森菌科_R-7群0.0410.0480.0110.327毛螺旋菌属_NK3A20_群0.091a0.027b0.0580.049狭义梭菌属0.0370.0550.0360.399理研菌属0.0740.0500.0380.299罗姆布茨菌属0.0600.0360.0260.093UCG-0050.1550.2020.5560.152未培养菌属0.0280.0390.0140.187未培养杆菌属0.077b0.128a0.0450.045未分类菌属0.033B0.057A0.0180.009拟杆菌属0.0140.0220.0180.490罗氏菌属0.013b0.038a0.0200.024螺旋杆菌0.0170.0220.0130.484丁酸弧菌属0.0240.0120.0110.074欧陆森氏菌属0.055a0.002b0.0400.013索氏梭菌属0.028a0.015b0.0120.037注：同行数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），无字母表示差异不显著（P0.05）。由图4、图5可知，C70组拟杆菌科（Muribaculaceae）、罗氏菌属（Roseburia）、梭状芽孢杆菌-UCG_014（Clostridia_UCG_014）相对丰度较高，C30组放线菌门（Actinobacteriota）、红蝽菌目（Coriobacteriales）、红蝽菌纲（Coriobacteriia）相对丰度较高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.F004图4基于分类信息的LEfSe分析的进化分支10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.F005图5基于分类信息的LEfSe分析的LDA分布2.4饲粮精粗比转换对牦牛粪便微生物菌群代谢途径的影响（见图6）由图6可知，通过PICRUSt 2功能预测，在KEGG水平2上，两组注释到功能中代谢 功能的相对丰度最高，其次是遗传信息处理、细胞过程和环境信息处理。在KEGG水平2上，2组注释到的基因主要在碳水化合物代谢、氨基酸代谢、辅助因子和维生素的代谢、萜类和多酮类化合物的代谢、其他氨基酸的代谢、脂质代谢、能量代谢、聚糖的生物合成和代谢、异种生物降解和代谢、核苷酸代谢、其他次生代谢物的生物合成、复制和修复、翻译、折叠、分类和降解、转录、膜运输、信号传导、细胞运动、细胞生长与死亡。C70组氨基酸代谢、辅助因子和维生素的代谢、聚糖的生物合成和代谢、脂质代谢、其他氨基酸的代谢、复制和修复、转录、细胞运动等代谢途径的表达量高于C30组。C70组能量代谢、萜类和多酮类化合物的代谢、异种生物降解和代谢等代谢途径的表达量显著低于C30组（P0.05）。C70组膜运输等代谢途径的表达量低于C30组。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.002.F006图6KEGG2注释的基因序列3讨论3.1饲粮精粗比转换对牦牛粪便菌群丰度与多样性的影响反刍动物后肠道内菌群对营养物质的消化利用具有重要作用，可在一定程度上反映动物机体的能量利用率[11]。庞凯悦等[12]研究发现，增加饲粮精粗比可以降低牦牛瘤胃菌群的多样性与丰度以及部分纤维相关降解菌的丰度。KUMAR等[13]研究发现，饲粮精料比例由20%增加至50%降低了产后荷斯坦牛瘤胃菌群的丰富度与多样性。本研究中，C70组牦牛粪便菌群的丰度和多样性较C30组有所降低，与上述研究结果相似。这可能与肠道内pH值的降低有关，精料碳水化合物的含量高于粗饲料，高精料会增加肠道乳酸含量，引起肠道pH值降低，进而降低了菌群的丰度。3.2饲粮精粗比转换对牦牛粪便菌群组成的影响本试验结果显示，在门水平上，牦牛粪便中主要的优势菌门为厚壁菌门和拟杆菌门。NIE等[14]对牦牛肠道菌群结构分布进行检测发现，牦牛生长过程中厚壁菌门和拟杆菌门丰度最高，与本试验结果相似，表明可以通过分析粪便样本研究牦牛后肠菌群的结构组成和功能。除反刍动物外，厚壁菌门和拟杆菌门在其他动物的胃肠道中也具有重要的作用[15-17]。厚壁菌门能够有效加速动物降解纤维素[18]，拟杆菌门可促进半纤维素、淀粉、果胶等的降解[19]。本试验中，饲粮精粗比转换的情况下，两组牦牛粪便中的厚壁菌门和拟杆菌门含量差异不显著，C70组中放线菌门相对丰度显著高于C30组。放线菌门是一类革兰氏阳性菌，具有分支的纤维和孢子，其大部分是腐生菌，也有寄生菌，可致病[20]。王书祥等[21]研究发现，补饲精料可显著提高牦牛的生产性能以及牦牛瘤胃放线菌门的丰度，但放线菌门属于有害菌类，表明生产中牦牛精料补饲量不宜过高。占今舜等[22]研究发现，增加精饲料能够促进瘤胃发酵，但会提高瘤胃中放线菌门和螺旋体门的丰度。本研究中，C70组牦牛粪便中放线菌门的相对丰度显著高于C30组，与上述研究结果相似，说明实际生产中牦牛的饲粮精粗比不宜过高。本试验发现，在属水平上，牦牛粪便中主要的优势菌属是UCG-005、未培养细菌、理研菌属、毛螺旋菌属_NK3A20_群。孙浩彬等[23]研究显示，荷斯坦牛粪便菌群的优势菌种为UCG-005、克里斯滕菌科R-7群、Monoglobus和理研菌科RC9肠道菌群，与本试验结果相似。而MEALE等[24]发现，断奶犊牛粪便中的优势菌种是未分类的瘤胃球菌科和拟杆菌科。MAO等[25]结果显示，荷斯坦牛粪便中的主要细菌是未分类的瘤胃球菌科、消化链球菌科和梭状芽孢杆菌，与本试验结果不相符。这可能是由于试验动物的品种、年龄及饲喂方式存在差异造成。罗氏菌属属于厚壁菌门，是一种产生丁酸的厌氧菌，对炎症性肠病、代谢综合征等多种疾病具有积极作用，对其他肠道菌群的多样性和丰度无影响[26]。罗氏菌属可以改善奶牛因M-FMT诱导的乳腺炎及肠道和乳腺中的微生物生态失调，并通过促进丁酸盐的产生从而限制细菌易位，丁酸盐与炎症信号抑制和屏障修复有关[27]。本研究中，C70组中罗氏菌属的相对丰度显著高于C30组，表明饲粮中适当提高精料比例有利于维持牦牛肠道健康。毛螺旋菌属_NK3A20_群、欧陆森氏菌属能够降解肠道内纤维类物质，促进动物机体短链脂肪酸的产生，进而下调肠道内pH值，抑制有害微生物的增殖，从而有利于维持肠上皮细胞的功能和形态，维持肠道菌群的稳态[28-31]。索氏梭菌属能够引起反刍动物的肠道感染、组织毒性感染和子宫内膜炎[32]。本试验结果显示，C30组中毛螺旋菌属_NK3A20_群、欧陆森氏菌属、索氏梭菌属的相对丰度显著高于C70组，说明饲料精粗比过高可能会使牦牛肠道微生物失衡，精粗比过低，导致牦牛患子宫内膜炎或引起肠道感染。3.3饲粮精粗比转换对牦牛粪便微生物菌群代谢途径的影响肠道菌群细胞在动物生理功能和饮食之间起到桥梁作用[33-35]。在同样的饲喂条件下，牦牛肠道菌群的预测功能优于肉牛，表明牦牛体内存在更多的能适应恶劣环境的菌群通路[36]。此外，牛和羊体内产生的短链脂肪酸及其比例也不同[37]。这可能与胃肠道的微生物组成、种类、肠道组织模式、饮食习惯等因素有关。对牦牛瘤胃细菌功能的预测表明，牦牛具有较多的碳水化合物代谢、氨基酸代谢、能量代谢、糖聚糖合成等基因家族，这些基因家族的差异可能与牦牛可以高效利用能量且适应性极强有关。本研究通过PICRUSt2基因功能的预测，发现饲粮精粗比的转换对牦牛粪便微生物群基因功能具有一定的影响。在KEGG代谢途径的二级水平上，试验期间牦牛粪便菌群的基因参与了碳水化合物代谢、氨基酸代谢、类脂物代谢、能量代谢等代谢相关通路。能量是动物生长发育不可缺少的，也是饲料配比必须考虑的重要部分。本试验结果显示，C30组能量代谢表达水平明显高于C70组，表明后期饲喂70∶30精粗比饲粮下调了牦牛的能量代谢通路。PANG等[38]研究表明，饲喂高精粗比饲粮会引起下调牦牛的能量代谢通路，进而影响牦牛的能量利用率。本研究表明，饲粮精料比转化可对牛粪便菌群的基因功能产生一定的影响，会通过调节粪便菌群改善牦牛的代谢，进而提高其生长性能。4结论本研究表明，随着饲粮中精料比例的增加，牦牛的粪便菌群中厚壁菌门和拟杆菌门的丰度增加，饲料利用率升高，罗氏菌属的相对丰度增加，有利于维持牦牛肠道健康。饲粮精粗比转换增加了螺旋菌属_NK3A20_群相对丰度，但提高了索氏梭菌属的相对丰度，增加了牦牛的肠道感染和子宫内膜炎的概率；增加了放线菌门的丰度，可能不利于牦牛的健康。因此，饲粮精料比例的增加在一定程度上提高了牦牛的生长性能，但会增加部分有害菌的比例，危害牦牛肠道健康。