桂闽引象草为禾本科多年生草本植物，具有生长快、成本低、营养价值高、产量高以及抗逆性强等优点[1-3]，是高产优良牧草[4-5]。桂闽引象草在夏秋季产量较高，但在冬季由于气温过低，象草生长受到阻碍或停止生长，特别是霜冻严重或下雪地区会死亡，从而导致新鲜桂闽引象草供应的季节性问题突出[6]。采用微贮处理桂闽引象草可以有效提高其营养价值，缓解桂闽引象草供求不平衡的问题。添加微生物添加剂有利于改善微贮效果，提高微贮稳定性，减少饲料营养损失[7]。研究表明，添加有机酸、乳酸菌、纤维素酶以及多种复合微生物制剂等能够提升桂闽引象草的微贮品质[8-10]。同时饲草含水量也是保证微贮质量的关键。桂闽引象草与玉米秸、花生秸、木薯酒精渣等含水量低的副产物原料混合青贮可提高其微贮的发酵品质[11-12]。本团队前期研究表明，桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮含水量为50%（混合比例为1∶1）时效果最好[13]。本试验在桂闽引象草与木薯酒精渣混合（鲜质量比为1∶1，水分为50%）微贮的基础上，通过添加不同微生物添加剂进一步改善混合微贮的发酵品质，提高有氧稳定性，从而选出最佳的微贮微生物添加剂，为南方高湿高温条件下桂闽引象草微贮饲料高品质调制技术提升及推广利用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验原料为桂闽引象草和木薯酒精渣，以1∶1鲜质量比进行混合微贮。新鲜的桂闽引象草于2022年12月在广西大学农业学院基地进行收割，选取高1.6~2.0 m的植株进行刈割，粉碎。木薯酒精渣购自当地饲料厂。添加剂：枯草芽孢杆菌（1.10×1011 CFU/g）、酵母菌（2.10×1011 CFU/g）、乳酸菌（3.00×1010 CFU/g）、地衣芽孢杆菌（1.10×1011 CFU/g）、植物乳杆菌（1.36×1010 CFU/g）购自山东中科嘉亿生物工程有限公司，活力99发酵剂（枯草芽孢杆菌≥6.0×106 CFU/g、产朊假丝酵母≥1.10×108 CFU/g、乳酸菌≥4.0×106 CFU/g）、混合型饲料添加剂（粪肠球菌固态Ⅰ型—012≥1.0×1010 CFU/g、乳酸菌≥4.0×106 CFU/g）和活力1号乳酸菌（枯草芽孢杆菌≥1.5×107 CFU/g、嗜酸乳杆菌≥3.0×106 CFU/g、乳酸菌≥6.0×106 CFU/g）等购自崇左市扶绥县当地。1.2试验设计本试验采用完全随机单因素设计，设4个处理组和1个对照组，每组3个重复，每组底物为15 kg桂闽引象草+15 kg木薯酒精渣。试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T001表1试验设计组别微生物添加剂CK组（对照组）无Ⅰ组6 g枯草芽孢杆菌+6 g乳酸菌+6 g酵母菌+6 g地衣芽孢杆菌+6 g植物乳杆菌Ⅱ组30 g（乳酸菌+枯草芽孢杆菌+产朊假丝酵母）Ⅲ组30 g（粪肠球菌+乳酸菌）Ⅳ组30 g（枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌+乳酸菌）1.3发酵液制备Ⅰ组直接添加6 g枯草芽孢杆菌+6 g乳酸菌+6 g酵母菌+6 g地衣芽孢杆菌+6 g植物乳杆菌，Ⅱ组直接添加30 g（乳酸菌+枯草芽孢杆菌+产朊假丝酵母），Ⅲ组直接添加30 g（枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌+乳酸菌），Ⅳ组添加发酵剂30 g（枯草芽孢杆菌+嗜酸乳杆菌+乳酸菌）、水100 mL，充分混合，静置1 h以上，使其充分活化。添加剂的使用均按照商品使用说明书进行。1.4微贮调制将粉碎后的桂闽引象草与木薯酒精渣按鲜质量比1∶1混匀，按照表1的试验设计，CK组不添加菌种，处理组按剂量添加不同微生物添加剂，充分混合后均匀喷洒在牧草表面，混匀后装入微贮袋中并封口，真空，置于室内避光、干燥处保存。60 d后开袋取样检测相关指标。1.5测定指标及方法1.5.1感官评定微贮饲料分别从色泽、气味、质地3个方面进行感官评定打分，感官评定标准见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T002表2感官评定标准项目色泽分值气味分值质地分值优等亮黄色14~20甘酸香味18~25松散软弱不粘手8~10良好褐黄色8~13淡酸味9~17中间4~7一般黄褐色1~7刺鼻酒酸味1~8略带黏性1~3劣等暗褐色0腐败味、霉烂味0发黏结块01.5.2常规营养成分采用烘干的方法测定干物质（DM）含量，具体测定步骤参照张丽英[14]的方法进行，采用凯氏定氮法测定粗蛋白（CP）含量[11]，灼烧法测定粗灰分（Ash）含量[15]，蒽酮-硫酸法测定可溶性碳水化合物（WSC）含量[16]，VAN SOEST等[17]的方法测定酸性洗涤纤维（ADF）、中性洗涤纤维（NDF）含量。按照杨胜[18]的方法测定钙（Ca）和磷（P）含量。淀粉（Starch）、矿物元素（Ca、P、Mg、K、S）以及氯离子（Cl-）等指标参照《发酵饲料分析检测技术》进行检测[19]。1.5.3发酵品质浸提后将浸提液通过定量滤纸过滤，采用pH计测定浸提液pH值[20]。挥发性脂肪酸（乙酸、丙酸和丁酸）含量参照柳俊超等[21]报道的方法测定。氨含量采用苯酚-次氯酸钠盐反应测定[22]。1.5.4营养物质消化率30 h中性洗涤纤维消化率、30 h体外干物质消化率参照《饲料分析及饲料质量检测技术》进行测定[18]。1.5.5有氧稳定性有氧稳定性的检测参照周倩等[23]的研究方法。取样结束后，将青贮料装回5 L聚乙烯桶中，不压实、不密封，室温放置，将温度传感器的探头插入桶中，桶口用锡箔纸覆盖，温度变化每8 h记录一次，测定微贮饲料在空气中暴露后其温度高出室温2 ℃所需要时间。1.5.6隶属函数评价采用隶属函数评价法对桂闽引象草与木薯酒精渣微贮饲料的各个指标进行评价。计算公式为：H(Ri)=(Ri-Rmin)/(Rmax-Rmin)(1)H(Ri)=1-(Ri-Rmin)/(Rmax-Rmin)(2)式中：H(Ri)表示某指标隶属函数值；Ri为该指标测定值；Rmax为该指标最大测定值；Rmin为该指标最小测定值。当测定指标与桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮品质呈正相关时用公式（1），当测定指标与桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮品质负相关时则用公式（2）[24]。1.6数据统计与分析采用Excel对数据进行初步整理，SPSS 24.0统计学软件进行单因素方差分析，Duncan's法进行多重比较。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮感官评价的影响（见表3）由表3可知，各组微贮饲料均为黄褐色，均为松散不粘手；Ⅰ组有甘酸香味，其他组均为淡酸味。综合以上结果得出，Ⅰ组得分最高为38.6，发酵品质相对较好，为优等，其余各组发酵品质均为良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T003表3不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮感官评价的影响项目色泽质地气味总分等级CK组黄褐色松散不粘手淡酸味24.60良好Ⅰ组黄褐色松散不粘手甘酸香味38.60优等Ⅱ组黄褐色松散不粘手淡酸味29.00良好Ⅲ组黄褐色松散不粘手淡酸味25.33良好Ⅳ组黄褐色松散不粘手淡酸味26.60良好2.2不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮营养成分的影响（见表4、表5）由表4可知，各组DM、CP和Ash含量差异均不显著（P0.05）。与CK组相比，Ⅳ组NDF含量显著降低（P0.05），Ⅰ组和Ⅱ组ADF含量显著降低（P0.05），Ⅱ组Starch含量显著降低（P0.05），Ⅰ组和Ⅲ组WSC含量显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T004表4不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮营养成分的影响组别DMCPAshNDFADFWSCStarchCK组51.50±2.0915.07±0.5916.77±0.3161.50±2.33a45.43±2.67a6.57±0.31b5.57±0.55aⅠ组51.47±2.5316.63±0.4716.43±1.3056.30±3.78ab41.13±1.80b7.87±0.72a6.17±0.31aⅡ组50.20±0.6615.70±0.3616.27±0.5056.23±2.86ab41.17±2.25b7.67±0.38ab3.40±0.26bⅢ组51.27±4.3615.57±0.4217.00±0.3657.10±2.91ab42.67±2.05ab8.00±0.79a5.53±0.55aⅣ组50.67±2.5214.67±0.5516.43±0.4955.07±1.40b42.23±0.42ab7.43±0.50ab5.43±0.15a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；表5~表7与此同。%由表5可知，与CK组相比，Ⅲ组的Ca含量显著升高（P0.05），Ⅱ组的K含量显著升高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T005表5不同生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮矿物元素和氯离子的影响组别CaPMgKSCl-CK组1.21±0.02b0.18±0.030.28±0.050.74±0.15b0.22±0.050.45±0.07abⅠ组1.17±0.03b0.15±0.070.28±0.070.75±0.10b0.23±0.040.46±0.19abⅡ组1.15±0.13b0.22±0.020.31±0.041.19±0.32a0.23±0.050.21±0.14bⅢ组1.30±0.09a0.22±0.040.28±0.020.76±0.20b0.23±0.070.40±0.20abⅣ组1.14±0.04b0.18±0.040.25±0.050.73±0.25b0.20±0.030.55±0.08a%与CK组相比，Ⅱ组的Cl-含量显著低于Ⅳ组（P0.05）。2.3不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮营养物质消化率的影响（见表6）由表6可知，Ⅱ组和Ⅲ组桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮的30 h中性洗涤纤维消化率均显著高于CK组和Ⅳ组（P0.05），各组的30 h体外干物质消化率差异均不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T006表6不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮营养物质消化率的影响组别30 h中性洗涤纤维消化率30 h体外干物质消化率CK组47.33±0.58c71.00±1.00Ⅰ组49.33±2.31bc72.00±1.00Ⅱ组53.33±0.58a71.33±1.15Ⅲ组51.67±2.08ab71.33±2.08Ⅳ组47.33±1.53c71.33±0.58%2.4不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮发酵品质的影响（见表7）由表7可知，与CK组相比，各处理组的pH值和氨含量差异均不显著（P0.05）。Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的乳酸含量显著高于CK组（P0.05），Ⅱ组的乙酸含量显著低于CK组（P0.05），Ⅰ组和Ⅲ组的丁酸含量显著低于CK组（P＜0.05）；各组中均未检出丙酸。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T007表7不同生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮发酵品质的影响组别pH值乳酸/%乙酸/%丁酸/%丙酸/%氨/%CK组4.06±0.04ab2.53±0.36d1.30±0.23a0.53±0.03aND1.61±0.23abⅠ组4.11±0.02ab3.60±0.39b1.40±0.34a0.16±0.10bND1.00±0.15bⅡ组4.06±0.10b4.18±0.18a0.47±0.37b0.25±0.08bND1.12±0.25abⅢ组4.17±0.15ab3.09±0.06c1.09±0.68ab0.70±0.17aND1.16±0.68abⅣ组4.28±0.06a2.39±0.04d1.69±0.32a0.66±0.22aND1.78±0.12a注：ND表示在样品中未检出该物质。2.5不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮有氧稳定性的影响（见表8）由表8可知，各组间有氧稳定性时间排序为Ⅳ组＞Ⅱ组＞Ⅲ组＞CK组＞Ⅰ组。Ⅳ组有氧稳定性显著高于其他组（P0.05），为246.67 h，比CK组高190 h。Ⅱ组有氧稳定性显著高于Ⅰ组、Ⅲ组和CK组（P0.05），较CK组高16.66 h。Ⅰ组的有氧稳定性最差，为48 h，显著低于其他组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T008表8不同微生物添加剂对桂闽引象草与木薯酒精渣混合微贮有氧稳定性的影响项目CK组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组时间56.67±0.58c48.00±1.00d73.33±1.52b57.00±1.00c246.67±0.58a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。h2.6不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣微贮品质和有氧稳定性的综合评价（见表9）将各组具有差异性的检测指标进行隶属函数分析，计算这些指标的隶属函数平均值并进行排序，平均值越大，说明综合价值越高[25]。由表9可知，Ⅰ组隶属函数平均值最高，CK组隶属函数平均值最低，各组综合评价排序为Ⅰ组（0.62）Ⅱ组（0.58）Ⅲ组（0.50）Ⅳ组（0.49）CK组（0.37）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.019.T009表9不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣微贮品质和有氧稳定性的综合评价项目CK组Ⅰ组Ⅱ组Ⅲ组Ⅳ组排序51234NDF0.240.660.670.630.85ADF0.300.800.790.620.67WSC0.100.610.520.650.44Starch0.730.900.090.720.6930 h中性洗涤纤维消化率0.170.420.920.620.17pH值0.660.440.700.340.19乳酸0.160.650.910.420.10乙酸0.670.730.200.550.89丁酸0.460.920.810.240.29氨含量0.520.730.570.600.12有氧稳定性0.050.010.150.060.99隶属函数平均值0.370.620.580.500.493讨论3.1不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮感官评定的影响感官鉴定是用于判断微贮料发酵品质最直观的方法，本试验依据《青贮饲料质量评定标准》[26]，综合微贮饲料的气味、色泽和质地等指标进行感官评定。本试验中，除了Ⅰ组感官评价等级为优等外，其他各组均为良好，其中CK组的感官评分最低，引起差异的主要指标是气味。原因主要是Ⅰ组添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌和乳酸菌补充了发酵底物和微生物浓度，促进了发酵反应，抑制霉菌等腐败菌的生长，从而使其发酵体系更加稳定[27]。阳建华等[28]和冯骁聘等[29]的研究也得出相似的结论。综上所述，生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣的感官评价具有积极作用。3.2不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮营养价值的影响桂闽引象草微贮料的营养价值可直接决定其微贮品质[30]。CP含量是评定饲料营养价值的重要指标之一，CP含量越高，表明饲料中可被利用的营养成分越高[3]。本试验中，各组CP含量无显著差异，但各处理组CP含量高于CK组，说明添加生物添加剂可以提高发酵料营养价值，这与吴跃明等[31]的研究结果一致。Ash含量过高说明饲料品质不好，饲料的质量及适口性较差[32]。本试验中，各处理组的Ash含量均低于CK组，表明生物添加剂对改善微贮料的适口性具有积极作用。CF是衡量微贮料能量消化率的主要指标，其含量过高会降低蛋白质和氨基酸的含量和有效性，影响多种营养成分状况。本试验发现，与CK组相比，各处理组NDF与ADF含量均呈下降趋势，可能是由于微生物添加剂改善了发酵条件，增加了微贮中乳酸菌的数量，微贮料中大量乳酸菌发酵利用了部分纤维而导致其微贮饲料NDF与ADF含量降低，这与王鸿泽等[33]的研究结果相一致。WSC可以直接为乳酸发酵底物提供能量，其含量越多，产生的乳酸越多，乙酸含量越低，微贮品质也越好[34]。本试验中，各处理的WSC含量均高于CK组，说明添加微生物添加剂可以保持微贮料中的WSC含量，保证微贮料的营养价值。3.3不同微生物添加剂处理对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮发酵品质的影响pH值是衡量微贮饲料发酵品质的重要指标之一，优质的微贮饲料pH值应低于4.20[35]。本试验结果显示，除了Ⅳ组外，其他组pH值均在4.20以下，表明微生物添加剂可以降低饲料pH值，改善微贮饲料品质。有机酸含量是评价微贮饲料发酵品质的重要指标，优质微贮饲料应具有较高的乳酸含量和较低的丁酸含量[36]。乳酸含量较高能够有效抑制霉菌生长，防止二次发酵，为微贮提供良好的厌氧条件，优质微贮饲料的乳酸含量应为4%~6%[37]。本研究中，Ⅱ组的乳酸含量高于4%，并且降低了乙酸、丙酸含量，为乳酸菌发酵提供了条件，从而改善了微贮发酵品质。4个处理中Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的乳酸含量高于CK组，Ⅳ组中的乳酸含量低于CK组。刘欢欢[38]研究表明，生物添加剂会显著增加各处理组中乙酸含量，而本试验除了Ⅱ组和Ⅳ组外，其他处理中的乙酸含量均降低，具体原因需进一步研究。氨含量反映了微贮饲料中粗蛋白和氨基酸分解的程度，该值越小说明氨基酸和粗蛋白分解越少，表明微贮效果越好。本试验中，Ⅰ组、Ⅱ组和Ⅲ组的氨含量均呈降低趋势，说明微生物添加剂在微贮中起到了抑制蛋白水解的作用，对微贮饲料品质起到积极作用，与宋十妹[39]、李如阳[40]的研究结果相似。3.4不同微生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮有氧稳定性的影响微贮饲料开袋后，由于与空气发生接触，一些有害霉菌的增殖活动增强，导致微贮饲料开始腐败，使微贮饲料难以保存[41]。微贮饲料开袋后的抗腐败能力是评价微贮饲料品质的重要因素之一[3]。穆胜龙等[42]研究表明，青贮饲料中较高的乙酸含量，可有效提高微贮饲料在空气中的有氧稳定性。本研究发现，Ⅳ组微贮饲料的有氧稳定时间最长，这与Ⅳ组乙酸含量较高相符，说明微生物添加剂对微贮饲料有氧稳定性具有积极作用。3.5不同生物添加剂对桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮品质和有氧稳定性的综合评价的影响由于各组微贮饲料的不同指标表现出差异，仅凭单一指标来评价最佳微贮组不够全面[43]。因此，本试验将各组具有差异性的指标（NDF、ADF、WSC、Starch、30 h中性洗涤纤维消化率、pH值、乳酸、乙酸、丁酸、氨含量及有氧稳定性）进行隶属函数分析，通过隶属函数的分析得出Ⅰ组的平均值最大，说明等比例添加枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、植物乳杆菌、酵母菌和乳酸菌微贮效果最好。4结论本试验结果表明，添加微生物添加剂可以影响桂闽引象草和木薯酒精渣混合微贮感官、发酵品质、营养品质及有氧稳定性。在实际生产中，闽引象草和木薯酒精渣混合微贮中添加枯草芽孢杆菌+地衣芽孢杆菌+植物乳杆菌+酵母菌和乳酸菌进行微贮较为适宜。