大量使用抗生素治疗奶牛乳房炎会使细菌产生耐药性，且乳中会残留抗生素影响人类健康[1]。姜黄素和姜黄挥发油具有抗炎、抗菌、抗氧化等作用，几乎无毒副作用和抗药性[2]。但是，姜黄素的机体有效利用率较低[3]。枯草芽孢杆菌可促进机体生长发育，增强免疫力，改善肠道形态和肠道菌群[4]，降解多种中草药[5]。本研究将姜黄素和姜黄挥发油混合，并与枯草芽孢杆菌复合使用，利用枯草芽孢杆菌降解姜黄提取物，以期提高姜黄素利用率，为临床防控奶牛乳房炎，制备新型纯天然、无毒副作用、无残留及不产生耐药性的添加剂提供参考。1材料与方法1.1试验动物在内蒙古鄂尔多斯达拉特旗骑士牧场随机选取90头二胎次、泌乳时间200~220 d、身体健康的泌乳中后期荷斯坦奶牛。1.2试验材料与设备姜黄购自内蒙古天立药业有限公司；枯草芽孢杆菌菌种（保藏号：CMCCB62501）购自武汉淼灵质粒平台；黄芪多糖购自齐鲁动物保健品有限公司；ELISA试剂盒购自上海宝曼生物科技有限公司；酶标仪（Synergy HT）购自上海迭戈生物科技有限公司；全自动乳成分分析仪（LactorStar）购自德国Funke Gerber。1.3试验设计与饲养管理采用单因素试验设计，将90头奶牛随机分成9组，每组10个重复。空白对照组（KB组，无添加）、阳性对照组（HQDT组，黄芪多糖100 g/d）；枯草芽孢杆菌组（KZ组，枯草芽孢杆菌1×109 CFU/mL，10 mL）、姜黄素高剂量组（JG组，姜黄素200 g/d）、姜黄素中剂量组（JZ组，姜黄素100 g/d）、姜黄素低剂量组（JD组，姜黄素50 g/d）、姜高菌高组（JGJG组，姜黄素200 g/d+枯草芽孢杆菌2×109 CFU/mL，10 mL）、姜中菌中组（JZJZ组，姜黄素100 g/d+枯草芽孢杆菌1×109 CFU/mL，10 mL）、姜低菌低组（JDJD组，姜黄素50 g/d+枯草芽孢杆菌5×108 CFU/mL，10 mL）。预试期7 d，正式试验期28 d。试验奶牛饲养在同一牛舍，每天饲喂添加剂1次。饲喂时，关闭牛颈夹，确认试验奶牛编号，将姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂与少量日粮混合均匀，逐一饲喂，颈夹关闭30 min，确保试验奶牛完全采食，放开牛颈夹，自由活动，自由饮水。奶牛基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.001.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量/%营养水平合计100.00苜蓿干草72.87泌乳净能/（MJ/kg）6.98羊草12.13粗蛋白/%17.56玉米青贮3.46中性洗涤纤维/%42.41玉米3.72酸性洗涤纤维/%23.56豆粕2.21钙/%1.12棉粕2.06磷/%0.78小米糠2.10苏打0.24食盐0.31预混料0.90注：1.每千克预混料含有：VA 2 400 kIU、VD 400 IU、VE 40 mg、铜5 mg、锰0.09 mg、锌1 000 mg、硒0.1 mg、钴0.14 mg、碘0.29 mg。2.营养水平中泌乳净能为计算值，其余为实测值。1.4混合型饲料添加剂的制备1.4.1姜黄素的制备采用分步提取法，粉碎姜黄，粒度80目；水蒸气蒸馏法提取姜黄挥发油约6 h，挥发油量不增加为止，干燥；再利用95%乙醇提取姜黄素，1.5 h/次，3次；过滤，提取液经120目不锈钢网过滤入贮罐，合并3次滤液；浓缩；利用95%乙醇进行醇沉12 h，温度10 ℃；回收乙醇；姜黄挥发油与姜黄素混合；加入辅料（糊精和蔗糖）；收膏；制粒；干燥过筛；灭菌；包装。后羿实业集团有限公司代为生产姜黄挥发油和姜黄素混合物，抽样检测提取浓度约75%。1.4.2枯草芽孢杆菌菌悬液的制备将枯草芽孢杆菌菌种接种到固体营养琼脂培养基中，37 ℃倒置培养24 h，挑取边缘褶皱的较大单个菌落于营养肉汤中，37 ℃培养24 h。在菌落生长对数期，用酶标仪测定在OD600 nm下的菌密度制成所需浓度，以悬浮液方式存放在4 ℃冰箱。1.5测定指标及方法1.5.1生产性能相关激素水平在试验期7 d、28 d，奶牛挤奶和采食前，尾跟静脉采血3 mL，分离血清，-20 ℃保存。按说明书用ELISA试剂盒检测血清中催乳素（PRL）、生长激素(GH)、促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）、促肾上腺皮质激素（ACTH）、皮质醇（Cor）、肾上腺素（E）、促甲状腺激素释放激素（TRH）、促甲状腺激素（TSH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、甲状腺素（T4）含量，采用酶标仪测出样品及标准品在OD450 nm处吸光值，根据标准品浓度及对应OD值得出标准曲线的回归曲线，计算各样本中激素水平相应浓度。1.5.2产奶量、乳成分样品采集：分别于试验期7、28 d的6：00、13：00和20：00点采集奶样150 mL。早、中、晚采集的奶样分别取100、75、75 mL均匀混合成250 mL放入取样瓶中，4 ℃冷藏保存，以待测定。检测方法：通过奶牛场奶厅采样器记录产奶量；乳脂肪率、乳蛋白率、非乳脂固体、体细胞数通过FossMilkosczn133B红外线分析仪进行测定。1.6数据统计与分析采用SPSS 17.0统计分析软件进行均值比较和单因素ANOVA分析，用Duncan氏法进行多重比较，数据以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂对奶牛血清中生产性能相关激素含量的影响（见表2）由表2可知，饲喂7 d时和28 d时，奶牛血清中PRL、GH、CRH、ATCH、COR、E、TRH、TSH、T3、T4含量在同时间点不同组间差异不显著（P0.05），在不同时间点同组间差异不显著（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.001.T002表2姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂对奶牛血清中生产性能相关激素含量的影响项目时间/dKB组HQDT组KZ组JG组JZ组JD组JGJG组JZJZ组JDJD组PRL/（ng/L）712.36±0.5413.16±0.2313.10±0.7813.49±0.7612.77±0.7412.57±0.7414.21±1.4213.41±1.6012.68±0.492812.53±0.4413.34±0.5513.15±0.9813.89±1.2913.06±1.012.63±0.6114.26±1.6713.92±1.1612.74±0.32GH/（μg/L）74.81±0.134.9±0.285.13±0.215.52±1.015.06±0.0884.86±0.216.51±1.115.16±0.624.88±0.19284.86±0.245.03±0.305.47±0.835.85±1.135.48±0.644.9±0.125.91±0.545.65±0.875.03±0.38CRH/（μg/L）77.51±1.017.48±1.197.10±1.137.87±1.217.68±1.446.58±0.318.16±1.687.48±0.667.19±0.52287.01±0.747.33±1.327.73±1.548.21±1.387.77±1.247.15±0.898.26±1.218.18±1.227.31±1.61ATCH/（ng/L）728.72±0.6928.89±2.8029.06±2.1429.94±2.0829.16±2.2628.72±0.9030.03±2.0229.48±1.5128.36±2.312827.85±2.4129.03±1.8129.07±1.3431.47±3.4929.22±1.9229.03±2.7231.96±2.0529.92±2.7128.56±1.30COR/（μg/L）773.97±2.6272.73±0.9571.44±2.8473.16±4.9572.57±2.4871.02±0.5871.2±3.5872.61±2.2271.91±0.702873.24±1.3073.35±4.0571.92±7.7173.50±3.5672.85±4.2872.12±1.2871.55±7.6173.33±2.1372.26±2.25E/（ng/L）775.06±4.1176.30±7.3976.39±3.9576.71±8.2676.48±6.2475.72±5.2977.24±9.1177.11±8.0675.58±6.692875.61±8.3375.37±9.5375.15±7.3476.59±9.0175.68±7.8274.12±5.1478.83±7.4377.53±9.0176.32±7.56TRH/（ng/L）717.68±0.5918.24±0.4018.23±0.4118.62±0.3218.26±0.5818.13±0.5019.11±1.4118.40±0.4517.95±0.192818.01±0.2218.49±1.2318.79±1.0518.97±1.6418.47±0.7018.15±0.7619.47±0.9318.76±1.2318.05±0.28TSH/（μIU/L）792.08±2.0494.26±5.2994.27±2.6896.68±5.3295.74±3.8892.9±5.8996.67±2.7796.54±2.7493.89±4.362893.27±2.8695.76±3.6396.74±5.0697.86±4.4296.73±3.3793.96±3.1995.53±1.8496.23±1.3294.22±3.15T3/（μg/L）71.28±0.051.41±0.091.40±0.011.53±0.251.42±0.121.32±0.081.55±0.111.49±0.181.34±0.06281.38±0.151.43±0.181.53±0.331.58±0.081.46±0.181.36±0.161.59±0.151.56±0.121.38±0.08T4/（μg/L）721.18±0.7922.91±0.6623.13±0.824.35±0.9723.35±1.2322.40±0.9825.12±1.5423.79±1.3822.71±1.622822.33±1.4123.56±1.3723.63±0.7125.59±1.5023.66±1.3822.69±1.0426.61±0.8424.72±1.1623.66±1.43注：同行数据无肩标字母表示差异不显著（P0.05）。2.2姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂对奶牛产奶量、乳品质的影响（见表3、表4）由表3可知，饲喂7 d时，HQDT、JZJZ、JG组奶牛产奶量显著高于KB组（P0.05）；HQDT、KZ、JGJG、JZJZ、JG、JZ组奶牛乳蛋白率显著高于KB组（P0.05）；HQDT、JG、JZJZ组奶牛乳中非乳脂固体含量显著高于KB组（P0.05）；HQDT、JZJZ、JG、JZ组奶牛乳中的体细胞数显著低于KB组（P0.05）；HQDT、JZJZ、JG、JZ组奶牛体细胞数显著低于KB组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.001.T003表3姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂对奶牛产奶量、乳成分的影响（7 d）组别产奶量/（kg/d）乳脂肪率/%乳蛋白率/%非乳脂固体/%体细胞数/（×104/mL）KB组23.10±0.62a3.75±0.103.18±0.03a8.47±1.14a19.77±1.97bHQDT组26.07±1.31b3.76±0.113.21±0.04b10.08±0.56b15.53±1.07aKZ组24.40±2.34a3.78±0.203.22±0.02b9.03±0.61a18.30±1.10bJG组26.43±0.56b3.85±0.063.22±0.01b10.27±0.48b15.93±0.35aJZ组24.63±1.12a3.77±0.173.24±0.02b9.92±1.44a15.96±0.72aJD组23.46±1.40a3.75±0.123.18±0.03a9.41±0.36a18.07±3.32bJGJG组25.24±2.05a3.79±0.193.21±0.02b9.44±0.58a18.03±1.72bJZJZ组26.83±0.81b3.87±0.073.24±0.02b10.00±0.67b16.43±1.00aJDJD组23.83±2.63a3.78±0.213.19±0.03a9.25±0.94a17.10±2.82b注：同列数据肩标小写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；相邻字母表示差异显著（P0.05），相间字母表示差异极显著（P0.01）；下表同。由表4可知，饲喂28 d时，HQDT、JZJZ、JG、JZ组奶牛产奶量显著高于KB组（P0.05）；HQDT、JZJZ、JG组奶牛乳蛋白率显著高于KB组（P0.05）；HQDT、JZJZ组奶牛乳中非乳脂固体显著高于KB组（P0.05）；HQDT、JZJZ、JG组奶牛乳中体细胞数显著低于KB组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.001.T004表4姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂对奶牛产奶量、乳成分的影响（28 d）组别产奶量/（kg/d）乳脂肪率/%乳蛋白率/%非乳脂固体/%体细胞数/（×104//mL）KB组23.60±1.36a3.82±0.063.22±0.02a8.71±1.14a19.07±1.18bHQDT组26.50±1.56b3.82±0.103.60±0.18b10.10±0.06b15.26±1.60aKZ组25.17±0.78a3.75±0.053.39±0.23a9.03±0.61a17.53±1.46bJG组26.43±0.65b3.86±0.033.61±0.22b9.27±0.48a15.73±1.93aJZ组25.53±0.67b3.84±0.083.26±0.06a9.92±1.44a16.60±0.70bJD组23.00±0.82a3.81±0.023.37±0.13a9.42±0.16a17.63±1.31bJGJG组24.90±1.51a3.75±0.103.46±0.34a9.46±0.58a17.57±1.40bJZJZ组26.63±1.12b3.78±0.113.61±0.22b10.01±0.67b15.90±2.23aJDJD组24.40±1.15a3.86±0.113.46±0.34a9.15±0.94a17.13±1.87b3讨论激素对动物的代谢、生长、发育和繁殖等生理活动起调节作用[6]。PRL促进乳腺发育，与肾上腺皮质激素协同发动泌乳，同时协同细胞因子促进淋巴细胞增殖和抗体产生，调节机体免疫功能[7]；GH促进蛋白质合成、抑制其分解，促进脂肪和脂肪酸分解供能，抑制葡萄糖的利用使血糖升高，使能量来源转向脂肪代谢[8]，并维持泌乳；下丘脑-腺垂体-肾上腺皮质轴促进蛋白质、脂肪分解，升高血糖浓度，调节应激对机体的不良反应；ACTH和Cor释放量增加使机体对有害刺激耐受力增强；E促进肌糖元分解、肝糖异生，血糖升高，加强脂肪组织脂肪分解，加快心跳，提高心输出量；下丘脑-腺垂体-甲状腺轴促进蛋白质、脂肪分解，升高血糖浓度，增加组织产热，促进机体生长发育。当奶牛T3、T4不足时，产奶量和乳脂率均降低[9]。本试验发现，奶牛日粮添加姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂对奶牛血清中生产性能相关激素（PRL、GH、CRH、ACTH、Cor、E、TRH、TSH、T3、T4）无显著影响（P0.05），但随着姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂饲喂剂量增加有部分增加，长期饲喂可能会达到更好的效果。有研究表明，长期使用姜黄素对内分泌有调理作用[10]。姜黄素可以逆转神经内分泌系统的异常、HPA系统的畸变和不可预测的慢性应激引起的行为缺陷。动物受到慢性应激会导致多种生理效应，例如血清皮质酮水平升高，肾上腺皮质厚度增加和糖皮质激素受体mRNA表达下调，但长期服用姜黄素可以缓解这些症状[10]，与本试验结果一致。该结果说明，长期饲喂姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂可维持机体稳态。日粮中添加中草药和微生态制剂能够提高泌乳奶牛的产奶性能。患乳腺炎荷斯坦奶牛饲喂复合植物提取物，可显著提高奶牛产奶量、乳蛋白率、乳糖率、非脂乳固体含量（P0.05），显著降低体细胞数（P0.05），改善乳品质[11]。荷斯坦奶牛饲喂复合益生菌制剂可显著提高产奶量、乳蛋白率、总固形物、乳糖率、乳脂率（P0.05），显著降低体细胞数（P0.05）[12]。本试验发现，JZJZ组奶牛产奶量、奶牛乳中的乳蛋白率、非乳脂固体显著高于空白对照组（P0.05），体细胞数显著降低（P0.05），奶牛乳品质得到改善，生产性能提高。无抗生素饲料添加剂是当前研究热点。以植物提取物和益生菌代替抗生素是有效的研究方向[13]。本试验从姜黄中提取姜黄素和姜黄挥发油，制成姜黄提取物，联合枯草芽孢杆菌使奶牛血清中生产性能相关激素水平保持稳态，提高奶品质和产奶量。其原因可能是饲喂姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂维持奶牛内分泌稳态，小幅度提高激素水平，不产生应激反应，降低日常应激对奶牛的影响。同时，姜黄素具有抗菌、抗炎、抗应激、抗氧化、提高免疫力等作用[14]，从而降低乳中体细胞数。枯草芽孢杆菌能改善反刍动物瘤胃微生态平衡，增加有益菌群数量，抑制致病菌生长，改变瘤胃发酵方式，促进纤维分解吸收，并通过分泌纤维降解酶等消化植物细胞壁，提高中草药利用率，从而提高机体对营养物质的消化，提高饲料利用率[15]，最终提高产奶量和乳品质。4结论姜黄素和枯草芽孢杆菌混合型饲料添加剂可维持生产和免疫相关激素稳态，提高奶牛产奶量、乳蛋白和非乳脂固体含量，降低体细胞数，改善牛奶品质。