罗非鱼具有生长周期短、存活率高、繁衍能力强等特点，是我国淡水鱼养殖的主要品种[1-2]。近年来，人工养殖的罗非鱼常受到疾病的侵扰，鱼类环境的变化，如水温、食物类型、病毒感染和细菌感染，会破坏肠道菌群的平衡，导致致病菌的异常生长。肠道菌群与疾病之间存在密不可分的联系[3]。研究显示，病鱼的肠道菌群多样性显著低于健康鱼，表明病原体入侵会导致肠道菌群紊乱[4-5]。因此，对肠道菌群的研究可为罗非鱼的健康养殖提供重要参考。由于饲料组成、生理状况和环境因素不同，养殖鱼类的肠道菌群与野生鱼类存在差异[6]。研究表明，饲料组成在肠道微生物群多样性中具有重要作用[7]。饲料中蛋白质和纤维素含量的提高会改变鱼的肠道菌群结构，促进肠道健康发展[8-10]。不同生存环境下，罗非鱼肠道微生物菌群分布及丰度也存在明显差异[11]。目前，大部分研究主要是某种物质对罗非鱼肠道菌群的影响，而养殖环境方面的研究相对较少。本研究基于Illumina Hiseq2500测序平台的高通量测序技术对野生和人工养殖尼罗罗非鱼肠道菌群的16S rDNA序列的V3-V4区进行测序，分析肠道微生物群落的多样性，为罗非鱼的养殖提供重要参考。1材料与方法1.1试验动物与样品采集野生尼罗罗非鱼采自柳州市柳江区里高镇牛腊河，体质量（1.00±0.20）kg。养殖尼罗罗非鱼采自柳州市柳江区沙塘农场罗非鱼养殖场，体质量（1.00±0.15）kg。分别对采样当日的牛腊河和养殖水体进行水质检测。牛腊河水质指标中氨氮（NH4-N）含量为0.144 mg/L，亚硝酸盐（NO2-N）含量小于0.002 mg/L，溶氧（O）含量为7.8 mg/L，磷酸盐（PO4-P）含量为0.038 mg/L，pH值为7.3。养殖水体水质指标为氨氮含量为2.504 mg/L，亚硝酸盐含量为0.161 mg/L，溶氧含量为5.2 mg/L，磷酸盐含量为0.066 mg/L，pH值为7.9。两组鱼分别取体质健壮、体表完好的6尾用于试验。野生样本表示为YS，养殖样本表示为YZ。将试验鱼用75%酒精消毒，断头，用无菌解剖剪剪开腹部取出肠道，去除肠道外的脂肪和血液，收集后肠管腔内容物后于-80 ℃冰箱中保存，用于肠道微生物组的高通量分析。1.2基因组DNA提取和基因文库构建DNA抽提和PCR扩增：肠道微生物样本DNA用E.Z.N.A.® Soil DNA Kit DNA试剂盒（Omega Biotek, U.S.）提取。1%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。NanoDrop 2000测定DNA浓度。Miseq文库构建：使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit试剂盒进行建库，用磁珠去除接头自连片段，而后进行PCR扩增，回收得到的PCR产物为Miseq文库。1.3高通量测序对MiSeq测序得到的PE reads进行样本拆分，根据测序质量对双端Reads进行质控和过滤，根据双端Reads之间的overlap关系进行拼接，获得质控拼接之后的优化数据，使用序列降噪方法处理优化数据，获得ASV（Amplicon Sequence Variant）代表序列和丰度信息。基于ASV，使用Majorbio云平台（www.majorbio.com）分析了样品的物种分类、群落多样性、物种差异和环境Spearman相关分析。2结果与分析2.1样品序列数统计结果（见表1）由表1可知，样品满足16S rDNA Illumina Hiseq 2500的测序要求。完成了12个样本的多样性数据分析，共获得优化序列604 828，碱基250 018 122 bp，平均序列长度414 bp，符合高通量测序要求。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.T001表1样品序列数统计结果样品序列数碱基数/bp平均长度/bpYS-142 98317 928 429417.105YS-234 10214 306 960419.534YS-343 24117 983 636415.893YS-444 82018 719 242417.654YS-547 23919 539 380413.628YS-644 08618 339 364415.991YZ-152 17621 437 638410.872YZ-249 12720 179 654410.765YZ-352 70021 717 507412.097YZ-487 85036 119 925411.155YZ-556 50523 260 257411.650YZ-649 99920 486 130409.7312.2两种养殖方式下鱼类肠道菌群的稀释性曲线（见图1）由图1可知，以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元，稀释曲线斜率随测序通量的增大而逐渐降低，最终趋于平稳，显示测序量已基本覆盖到样品中的所有物种，测序数量接近饱和。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F001图1两种养殖方式下鱼类肠道菌群的稀释性曲线2.3Alpha多样性指数及差异分析（见表2）由表2可知，YS组罗非鱼的香农指数显著高于YZ组（P0.05），辛普森指数显著低于YZ组（P0.05），表明野生和养殖两种模式下罗非鱼肠道菌群的多样性差异显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.T002表2Alpha多样性指数及差异分析组别总OTU数香农指数辛普森指数群落丰富度指数YS395.175.281*0.014*395.2YZ300.674.2550.051333.5注：“*”表示组间差异显著（P0.05）。2.4两种养殖方式下罗非鱼肠道菌群Beta多样性分析结果（见图2）基于物种丰度信息，在门分类水平上进行主坐标分析，见图2（a）。相同颜色的点彼此之间的距离代表了菌群的差异程度。由图2（a）可知，YS组各样本间距离较短，说明野生组罗非鱼肠道菌群之间的差异小，YZ组各样本间距离较长，说明养殖组罗非鱼肠道菌群间的差异大；野生和养殖鱼整体之间的距离明显被区分，表明野生组和养殖组的肠道菌群有较大差异。图2两种养殖方式下罗非鱼肠道菌群Beta多样性分析结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F2a1（a）主坐标分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F2a2（b）非度量多维尺度分析对两组进行非度量多维标定分析（NMDS），结果见图2（b）。由图2（b）可知，YS组与YZ组肠道菌群间的相似度低。2.5罗非鱼肠道菌群结构组成分析结果（见图3）根据分类结果，12个尼罗罗非鱼肠道样品中得到的细菌归属于26个门379个属576个种。由图3可知，野生尼罗罗非鱼肠道以Actinobacteriota、Proteobacteria和Firmicutes为主要优势菌群；养殖尼罗罗非鱼以Actinobacteriota、Proteobacteria和Cyanobacteria为主要优势菌群。在属水平上，YS组鱼肠道菌群优势菌有g_norank_f_Steroidobacteraceae菌属、g_norank_f_SC-I-84菌属和g_norank_f_norank_o_Chloroplast菌属；YZ组鱼肠道菌群优势菌有g_Mycobacterium菌属、g_norank_f_Rhizobiales_Incertae_Sedis菌属和g_norank_f_norank_o_Chloroplast菌属。图3罗非鱼肠道菌群结构组成分析结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F3a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F3a2（b）属水平2.6肠道菌群物种差异分析（见图4）由图4（a）可知，在门水平上，YS组和YZ组组间有6个菌门存在显著性差异（P0.05）。YZ组的Proteobacteria极显著低于YS组（P0.01），Cyanobacteria显著高于YS组（P0.05），Acidobacteriota、Bacteroidetes显著低于YS组（P0.05），Dependentiae菌门极显著高于YS组（P0.01），NB1-j菌门极显著低于YS组（P0.01）。由图4（b）可知，在属水平上，YS组和YZ组组间有9个菌属存在显著性差异（P0.05）；YZ组的norank_f_norank_o_Chloroplast、Mycobacterium、Paeniclostridium、IMCC26207、Methylocystis、Conexibacter极显著高于YS组（P0.01），Exiguobacterium、norank_f_Steroidobacteraceae极显著低于YS组（P0.01），norank_f_SC-I-84菌属显著低于YS组（P0.05）。图4两种养殖方式下罗非鱼肠道菌群的物种差异分析结果注：“*”表示差异显著（P0.05），“**”表示差异极显著（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F4a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F4a2（b）属水平2.7水体环境因子对野生和养殖鱼群落结构的相关分析（见图5）为了解环境因子对野生和养殖鱼门类和属类群落结构的影响，本研究对两组鱼的肠道菌群和环境因子进行Spearman相关分析。由图5（a）可知，在门水平上，环境因子对不同分组样本中物种数据分布的影响程度排序为pH值NH4-NNO2-NOPO4-P。图5两种养殖方式下罗非鱼肠道菌群的冗余分析结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F5a1（a）门水平10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.011.F5a2（b）属水平由图5（b）可知，在属水平上，环境因子对不同分组样本中物种数据分布的影响程度排序为NO2-NNH4-NpH值OPO4-P。NH4-N、NO2-N、PO4-P和pH值间存在正相关性，O与NH4-N、NO2-N、PO4-P和pH值均是负相关关系。O对野生组罗非鱼肠道菌群群落分布产生正向影响（P0.05），NH4-N、NO2-N、PO4-P和pH值对养殖组罗非鱼肠道菌群群落分布产生正向影响（P0.05）。3讨论肠道菌群参与鱼类营养物质的消化和吸收，促进宿主的生长。鱼类的生理状态会对其菌群结构产生影响，进而影响鱼的生理状态。本研究考虑到栖息地的不同对尼罗罗非鱼的影响，采用16S rDNA测序方法对野生和人工养殖尼罗罗非鱼的肠道内容物进行测序，研究了罗非鱼的肠道微生物群。结果表明，人工养殖会改变罗非鱼肠道菌群结构、微生物组成及其多样性，提示不同的生活环境会对肠道菌群产生影响。3.1罗非鱼的肠道菌群结构分析本试验发现，所有尼罗罗非鱼样本的核心肠道微生物群包括Actinobacteriota、Proteobacteria、Firmicutes和Cyanobacteria，与BEREDED等[12]的研究结果一致，认为Proteobacteria、Firmicutes、Cyanobacteria和Actinobacteria是尼罗罗非鱼肠道微生物群的主要群体。也有研究表明，尼罗罗非鱼肠道的优势门为Fusobacteria、Bacteroidetes和Proteobacteria[13]。微生物群组成存在差异的原因可能是饲养环境条件、饮食组成和遗传谱系不同。尼罗罗非鱼幼虫的肠道细菌群落受到饲养环境（循环或主动悬浮系统）的显著影响[14]。饲料添加丁酸梭菌或粪肠球菌可显著改变罗非鱼肠道微生物结构和组成[15]。鱼类基因型和肠道微生物组合之间存在强相关性[16]。Firmicutes参与膳食纤维的发酵并调节肠道膳食脂肪的吸收，其主要代谢产物是丁酸，是肠上皮细胞的主要能量来源，可通过增加上皮吸收细胞促进肠道健康[17]。3.2养殖环境对罗非鱼肠道微生物群的影响本研究结果表明，人工养殖会改变罗非鱼肠道菌群结构，与苟妮娜等[18]和朱俊[19]的研究结果一致。苟妮娜等[18]和朱俊[19]认为，不同养殖环境下多鳞白甲鱼和大黄鱼的菌群结构存在差异。研究发现，不同养殖环境条件下的金背鲤、鳙鱼和尼罗罗非鱼肠道菌群组成也存在差异[20-22]。饲料中添加益生菌补充剂可显著改变尼罗罗非鱼的肠道微生物组成，调节罗非鱼生长和免疫力，进而影响肠道代谢[23]。不同的蛋白成分和氨基酸组成对肠道微生物细菌组成具有明显影响[24]，低蛋白饮食会降低尼罗罗非鱼肠道微生物的多样性[25]。饲料中添加适宜的纤维可改善肠道健康，从而促进机体生长[26]。饥饿会影响尼罗罗非鱼肠道中的微生物群[27]。养殖水体温度过高或氧气含量低是尼罗罗非鱼感染无乳链球菌的诱因[28]。因此，养殖环境会改变肠道微生物群。3.3野生与人工养殖罗非鱼肠道微生物群的分析近年来，人工养殖的尼罗罗非鱼时常受到疾病的侵扰。肠道微生物组在宿主健康中起到重要作用，并影响疾病的发展[29]。肠道内细菌种类能够反映宿主健康及代谢能力。研究表明，肠道内细菌种类的数量越少，微生物群落功能稳定性越差，宿主患病风险越大[30]。研究发现，健康鱼的肠道内细菌种类的数量显著高于患病鱼[31]。与健康的鱼相比，患病半滑舌鳎肠道内细菌种类的数量明显降低[32]。感染草鱼呼肠孤病毒组肠道菌群的Alpha多样性指数显著低于对照组[33]。本研究结果表明，养殖型尼罗罗非鱼肠道菌群多样性显著低于野生型，这可能是养殖尼罗罗非鱼更易暴发疾病的原因。本研究表明，门水平上，野生与人工养殖尼罗罗非鱼间有6个菌门存在显著性差异，与野生组相比，人工养殖组Proteobacteria、Actinobacteriota、Bacteroidota和NB1-j菌门丰度降低，Cyanobacteria、Dependentiae丰度增加。Proteobacteria通常兼性或专性厌氧，能够耐受一系列毒性病症，有助于维持肠道厌氧环境的稳态[34]。Actinobacteriota可产生各种强效抗生素，抑制肠道致病菌的生长，通过促进新陈代谢促进肠道环境稳定[35]。Bacteroidota为革兰氏阴性菌，也存在于杂食性鱼类和哺乳动物的肠道微生物中，它们可能促进摄入的多糖的分解[36]。Cyanobacteria过度生长可能会改变病原体和正常细菌微生物群落之间的适当平衡，产生神经毒素β-甲氨基-L-丙氨酸（BMAA），导致宿主产生疾病[37]。研究表明，肠道中Cyanobacteria丰度与胃肠道疾病之间存在正相关关系[38]。研究表明，Dependentiae的成员是多种水生生物的病原体[39]。本试验发现，在属水平上，野生组和养殖组组间存在9个菌属的显著性差异，与野生组相比，养殖组norank_f_norank_o_Chloroplast、Mycobacterium、Paeniclostridium、IMCC26207、Methylocystis、Conexibacter丰度增加，Exiguobacterium、norank_f_Steroidobacteraceae和norank_f_SC-I-84丰度降低。研究表明，Mycobacterium中的Mycobacterium marinum会导致淡水鱼类感染死亡，使鱼类患上类似人类肺结核的疾病[40]。Methylocystis会延缓鱼类生长，产生的毒素会引起肿胀、腹部不适、局限性病变以及嗜睡行为[41]。Exiguobacterium可去除水中的砷，会通过减少氧化损伤来保护鱼类免受砷的损害[42]。因此，人工养殖会改变尼罗罗非鱼肠道菌群的群落结构，导致肠道中致病菌丰度增加，有益菌丰度降低，使尼罗罗非鱼的肠道菌群失衡，免疫力降低，进而导致疾病暴发。3.4环境因子对罗非鱼肠道菌群的影响本研究表明，环境因子也会对肠道菌群产生影响，磷酸盐对尼罗罗非鱼肠道菌群的影响小，这可能是因为环境污染导致水体富营养化，水体中磷含量高，导致尼罗罗非鱼产生适应性变化。但目前没有明确的试验可以验证这个结论，还需要进一步研究。由于鱼类本身处于水环境中，细菌的生长环境与周围的水环境密切相关。因此，肠道菌群的平衡易受到外部水环境中各种因素的影响[43]。包括温度、盐度、溶氧量、pH值、亚硝酸盐含量和氨氮含量等。SIRIYAPPAGOUDER等[44]研究表明，水质会对水生动物的生长发育和鱼类肠道微生物的结构组成和多样性产生影响，进而促进鱼类疾病的发生。NEUMAN等[45]发现，养殖大西洋鲑鱼肠道微生物变形杆菌门在较高温度（14~18 ℃）时占主导地位，在较冷的温度（10~12 ℃）下消失。盐度的改变会导致肠道理化因素发生变化，包括胃酸度、消化酶和胆盐。这些变化会影响硬骨动物中特定微生物的肠道定植，降低肠道微生物的丰富度和均匀度，导致肠道微生物组成发生变化，降低宿主自身的免疫力[46]。KARLSEN等[47]研究表明，溶氧量低会导致鱼类死亡。pH值下降对鱼类的细菌群落结构产生显著影响，进而导致鱼类自身微生物生态失调[48]。目前经常使用集约化循环水养殖系统饲养鱼类，其中水回用率高，会导致硝酸盐等废弃物在水中堆积。YU等[49]发现，用硝酸盐处理鱼类后，鱼类一些潜在病原体的丰度高于正常组。氨是一种强效的神经毒素，高氨水平会损害多种组织和细胞功能并导致鱼类死亡[50]。戚晓舟[51]研究表明，在氨氮的胁迫下，鲫鱼的肠道菌群发生了紊乱，提高了鲫鱼患病的概率，表明环境因子会对肠道菌群产生影响。4结论本研究表明，人工养殖会改变尼罗罗非鱼的肠道菌群结构，野生和人工养殖罗非鱼肠道菌群产生差异的主要原因是饲养环境条件、饮食组成和遗传谱系的影响。研究结果可为罗非鱼的健康养殖，养殖罗非鱼饲料的开发以及对人工养殖环境的改善提供参考。