蓖麻粕是蓖麻籽生产蓖麻油后的工业副产物，其中含有30%~40%粗蛋白质、30%~40%碳水化合物和5%~10%粗脂肪[1]。但蓖麻粕中含有蓖麻碱、变应原等毒素，不利于动物机体健康，很难被作为动物饲粮使用[2]。黑水虻幼虫能够将有机废弃物转化为富含脂肪和优质蛋白质的昆虫生物质，如将餐厨垃圾[3]、禽畜粪便[4]、工农业副产物[5]，农作物秸秆[6]和棕榈果废弃物[7]转化为自身营养物质。目前，蓖麻粕代替部分饲粮对石斑鱼[8]和肉鸡[9]的生长具有负面影响。黑水虻幼虫粉作为动物的饲粮已被广泛研究，黑水虻虫粉代替部分饲粮可以有效提高蛋鸡[10]和凡纳滨对虾[11]机体的抗氧化能力和免疫水平。而蓖麻粕作为黑水虻饲粮的研究结果较少。本研究通过黑水虻幼虫利用蓖麻粕中优质生物质，测定幼虫的生长速度、存活率、肠道微生物变化情况以及饲粮中粗蛋白和粗脂肪的减少量，探究蓖麻粕对黑水虻幼虫生长的影响，从而利用蓖麻粕代替豆粕作为黑水虻的饲粮，实现蓖麻粕资源的高效利用。1材料与方法1.1试验材料黑水虻虫卵由武汉工程大学养殖基地提供；蓖麻粕、豆粕和麦麸分别购自东宇农业科技、富农商铺和农副产品百货。利用粉碎机将蓖麻粕和豆粕粉碎，过50目标准筛，备用。1.2试验设计与饲养管理黑水虻虫卵经过麦麸孵化至3日龄。选取4 500只3日龄幼虫，分别按幼虫和饲粮比（500只∶100 g）添加到豆粕组（SM组）、50%豆粕和50%蓖麻粕组（SCM组）、蓖麻粕组（CM组），每组3个重复。黑水虻幼虫在直径20 cm的圆形饲养盒中饲养，试验期12 d。所有幼虫饲养温度为（30±1）℃，湿度为（70±1）%。1.3测定指标及方法1.3.1幼虫生长、存活率和死亡率试验过程中，每天对黑水虻幼虫体重（湿重）和体长进行称重与测量，并绘制幼虫生长曲线。在饲养前对加入的幼虫总数量和饲养结束时剩余幼虫的总数量进行计数。1.3.2饲粮、虫沙及幼虫营养指标分别对饲养前饲粮和饲养结束后的虫沙和幼虫进行取样，冷冻干燥至恒重。根据GB 5009.3—2016测定虫沙和幼虫的水分含量，GB/T 6432—2018测定粗蛋白（CP）含量，GB/T 14772—2008测定粗脂肪（EE）含量，GB 5009.4—2016测定粗灰分（Ash）含量，GB 5009.87—2016测定总磷（TP）含量，GB 5009.91—2017测定钾（K）含量，GB 5009.92—2016测定钙（Ca）含量，GB 5009.14—2017测定锌（Zn）含量。1.3.3幼虫肠道DNA提取及测序分析（1）DNA提取。在饲养结束时，每组分别随机选取20只黑水虻幼虫，分离肠道，-80 ℃保存，用于肠道DNA提取及分析。使用粪便FastDNA Spin试剂盒，根据说明从黑水虻幼虫肠道中提取微生物DNA。提取的DNA样本被送往中国广东美格基因科技有限公司。使用引物（338F和806R）从DNA样品中PCR扩增包含V3-V4 16S rDNA高变区的序列。使用Illumina Nova 6000平台对构建的扩增子文库进行PE250测序和生物信息学分析。（2）测序分析。应用扩增子分析软件（quantitative insights into microbial ecology，QIIME 2）分析黑水虻幼虫肠道DNA 16S rRNA高通量测序数据。序列分析通过Uparse软件（Uparse v7.0.1001）进行。序列数据通过V3-V4序列的读取和鉴定进行处理，过滤和分配操作分类单元（operational taxonomic unit，OTU）。相似性≥97%的序列被分配给相同的OTU。通过OTUs聚类、物种注释和丰度分析揭示了样品的物种组成。1.4数据统计与分析使用SPSS 25软件对试验数据进行检验分析，使用t检验分析确定不同组之间生物标志物和肠道微生物群的统计学显著差异，使用Origin 2023软件制作图形。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1饲粮和虫沙的营养水平测定结果（见表1）由表1可知，饲粮经黑水虻转化后，CM组虫沙的CP、EE含量显著低于SM组和SCM组（P0.05），CM组和SCM组饲粮的Ash含量显著高于SM组（P0.05）。研究表明，蓖麻粕中CP和EE减少量较多，而Ash含量增加。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.014.T001表1饲粮和虫沙的营养水平测定结果（干重）组别饲养前饲养后饲粮CP饲粮EE饲粮Ash虫沙CP虫沙EE虫沙AshSM组40.07±0.249.58±0.137.93±0.39c28.59±0.74a6.43±0.29a8.33±0.12cSCM组39.91±0.729.53±0.168.86±0.08b27.94±0.68a5.86±0.49a10.22±0.15bCM组39.15±1.529.67±0.229.91±0.28a21.23±0.91b4.21±0.22b13.54±0.38a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.2不同饲粮对黑水虻幼虫生长性能的影响（见表2、图1）由表2可知，SM组、SCM组和CM组饲养的黑水虻幼虫存活率在98.93%~99.07%，死亡率在0.93%~1.07%之间。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.014.T002表2不同饲粮对黑水虻幼虫生长性能的影响组别剩余幼虫/头存活率/%死亡率/%SM组495.33±3.0699.07±0.500.93±0.50SCM组495.00±3.0099.00±0.601.00±0.60CM组494.47±4.7398.93±0.951.07±0.95由图1可知，试验1~3 d，黑水虻幼虫体长和鲜重的曲线生长较缓慢，4~8 d为快速生长期，9~12 d时幼虫生长趋于平缓。在第12 d时，CM组的黑水虻幼虫鲜重达到1.37 g/10只，生长速率比其他两组更高。研究表明，使用蓖麻粕可以增加黑水虻幼虫的体重。图1不同饲粮对黑水虻幼虫体长和鲜重的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.014.F1a1（a）体长 （b）鲜重2.3不同饲粮对黑水虻幼虫肠道微生物多样性及丰富度的影响（见图2）利用16s rRNA高通量测序检测黑水虻幼虫肠道细菌丰富度和多样性。在Alpha多样性中，Chao1指数越大，群落丰富度越高，Shannon指数越大，群落多样性越高[12]。由图2（a）可知，3组饲粮饲养的幼虫肠道微生物丰度无显著改变（P0.05）。由图2（b）可知，SCM组以及CM组的Shannon指数低于SM组，表明微生物多样性出现下降趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.014.F002图2黑水虻幼虫肠道微生物变化由图2（c）可知，3组饲粮饲养的黑水虻幼虫肠道细菌属水平均为21类（0.5%）。CM组的幼虫肠道微生物中的Enterococcus、Providencia、Ignatzschineria和Proteus相对丰度分别为52.30%、6.25%、8.91%和3.99%。而在SM组的幼虫肠道中Enterococcus、Providencia、Morganella、Actinomyces和Dysgonomonas相对丰度分别为32.03%、6.84%、16.50%、4.44%和7.94%。结果表明，蓖麻粕的摄入不会明显改变黑水虻幼虫肠道中微生物的丰富度和多样性，同时不会使幼虫肠道主要菌群中某单一菌群无法生长。2.4不同饲粮对黑水虻幼虫粉营养水平的影响（见表3）由表3可知，CM组的黑水虻幼虫CP、EE、Ash、Ca含量均显著高于SM组和SCM组（P0.05），TP和K含量显著低于SM组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.04.014.T003表3不同饲料对黑水虻幼虫粉营养水平的影响（干重）组别CPEEAshTPKCaZnSM组38.79±1.02b24.46±0.71b6.83±1.27c1.02±0.04a2.06±0.15a1.06±0.25c0.02±0.01SCM组39.67±0.49b25.47±0.52b9.69±0.93b0.92±0.03b1.92±0.22b1.54±0.04b0.02±0.01CM组41.49±0.77a27.30±1.33a12.31±0.66a0.86±0.07b1.86±0.18b2.10±0.05a0.02±0.01%3讨论3.1不同饲粮营养水平分析本试验发现，饲养前后CM组饲粮和虫沙的Ash含量均显著高于SM组。这是由于蓖麻粕与豆粕的营养水平无明显差异[13]，但蓖麻粕的外壳含有较少的CP和EE，主要由CF、Ash和植酸盐等组成[14]，其属于黑水虻幼虫难以食用的坚硬部分，所以CM组虫沙的残留物主要是蓖麻粕壳。除营养水平外，饲粮的利用效率可能与饲粮的膨松度相关。蓖麻粕壳可作为饲粮的膨松剂，能够提高CM组饲粮的膨松度。因此，与SM组相比，CM组黑水虻幼虫对CP和EE的食用效率更高，表明黑水虻幼虫可有效利用蓖麻粕中的CP和EE。3.2不同饲粮对黑水虻幼虫生长的影响本试验中，CM组的黑水虻幼虫存活率为98.93%，低于SM组，3组黑水虻幼虫存活率和死亡率无明显差异。这是由于饲粮的营养水平和水分含量等会影响幼虫的存活率[15]，表明蓖麻粕代替豆粕不会影响黑水虻幼虫的存活率。本试验发现，3组黑水虻幼虫生长规律相似，前期生长较缓慢，中期快速增长，育蛹期前趋于平缓，预示着幼虫期的能量积累即将完成，与李林笑[16]等探究的黑水虻幼虫生长规律相似。但饲养结束时，CM组黑水虻幼虫末重高于SM组，说明饲粮的高营养水平可满足黑水虻幼虫正常生长的需求。本试验中，随着蓖麻粕含量的增加，SCM组和CM组黑水虻幼虫生长速度增加，说明蓖麻粕的高膨松度可能有利于提高黑水虻幼虫的生长速度。同时，蓖麻粕中高含量的微量元素，如钙等，可能会促进黑水虻幼虫对粗蛋白和粗脂肪的消化利用。蓖麻粕中含有蓖麻碱和变应原等毒素，会影响动物的存活率和生长性能，蓖麻粕代替豆粕，雏鸡死亡率高达83%[17]，对成年肉鸡[9]和石斑鱼[18]的生长仍会产生不良影响；蓖麻粕完全代替豆粕等会影响牛[19]和羊[20]的生长性能。本试验发现，蓖麻粕不会影响黑水虻的存活率，且未减少幼虫的生物量，表明以蓖麻粕可以有效促进黑水虻幼虫的生长。3.3不同饲粮对黑水虻幼虫肠道细菌群落的影响本试验发现，CM组、SCM组和SM组的黑水虻幼虫肠道细菌丰富度和多样性无显著改变，并且其主要细菌类型无显著差异。这是因为改变饲粮会使黑水虻肠道的细菌群落进入自我调节状态[21]，而黑水虻幼虫肠道细菌丰富度和多样性较高，会使肠道菌落环境相对稳定，即使饲粮的营养水平不同，其主要细菌类型也难以改变。肠道微生物群落是调节宿主健康的关键因素之一[22]。本试验研究结果表明，CM组的Enterococcus、Providencia、Ignatzschineria和Proteus等菌属出现较高的生物活性，说明黑水虻幼虫可能存在对蓖麻粕中如蓖麻碱和变应原等毒素的应对机制。这一机制可能是细菌产生降解蓖麻碱的水解酶或细菌产生毒素催吐素[23]，以及细菌对蓖麻碱的耐药性[24-25]，并且黑水虻肠道细菌群落的自我调整可能更有利于对蓖麻粕中粗蛋白和粗脂肪的转化利用。因此，蓖麻粕饲粮并不会对黑水虻的肠道细菌群落产生改变，并且这一改变可能更有利于黑水虻的生长。3.4不同饲粮对黑水虻幼虫粉营养水平的影响本试验中，蓖麻粕可以有效提高黑水虻幼虫营养水平，如CP、EE、Ash和Ca含量等，能够使TP和K含量维持在一定水平。黑水虻幼虫中富含EE、CP、矿物质和抗菌肽等物质，可以作为优质的蛋白质资源应用于动物生产中[26-28]。ZHANG等[29]研究发现，黑水虻幼虫粉可以减少幼鸡的发病率和死亡率。赵燕等[30]研究发现，黑水虻虫粉不会影响肉鸡的生长性能，但可以有效提高肌肉的蛋白质和脂肪酸等含量。有研究指出，黑水虻虫粉可在不影响养殖鱼的成活率和生长指标情况下，有效改善鱼的体内酶活[31]和肠道微生物菌群结构[32]。并且，黑水虻虫粉有望成为牛和羊等动物减少使用抗生素的替代品[33]。因此，在营养水平和动物需求方面，黑水虻幼虫粉具有较大的天然优势。4结论本研究结果表明，蓖麻粕作为饲粮对黑水虻幼虫的生长、存活率无负面影响，有利于幼虫的CP和EE积累，可保持黑水虻幼虫的肠道健康，表明蓖麻粕作为黑水虻幼虫饲粮是安全可行的。