桑叶又名家桑、黄桑叶、荆桑，常作为蚕的日常饲料，是一种药食两用的植物，具有除热散风、明目清肝等功效[1-2]。桑叶中含有多糖[3]、黄酮[4]、生物碱[5]、多酚[6]等活性成分，其中桑叶多糖含量占干桑叶的1.79%~2.64%，由D-甘露糖、D-果糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖和D-木糖等组成[6]。桑叶具备抗氧化[7-8]、抗衰老[9]、降血糖[10]、抗高血脂[11]、抗凝血[12]、抗肥胖[13]和抗炎[14-15]等生物活性。桑叶多糖可以有效降低动物的死亡率，增强机体的免疫功能[16-17]。张波等[18]研究表明，在蛋鸡饲粮中添加0.8%桑叶提取物能够降低料蛋比，提高肠道有益菌群含量和免疫功能。目前，桑叶多糖的提取方法主要包括浸提法、超声波提取法、微波提取法和酶解法等[19-21]。热水浸提法是一种广泛应用的传统多糖提取技术，其提取效果受到多种因素的影响，包括液料比、浸提温度以及浸提次数等。本研究采用热水浸提法提取桑叶中的多糖，探索不同提取条件下桑叶多糖提取率的影响，通过正交试验优化提取工艺参数，确定最优工艺参数组合，研究桑叶多糖的体外抗菌活性，为桑叶多糖的抗菌研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料与仪器桑叶样品购自四川某食品公司，浓硫酸、无水乙醇、苯酚、正丁醇、氯仿均购自国药集团，D-无水葡萄糖标准品（货号YZ-110833）购自北京索莱宝科技有限公司。试验仪器包括粉碎机、超微粉碎机、高速冷冻离心机、旋转蒸发仪、高压灭菌锅、电热恒温培养箱和紫外分光光度计等。1.2试验方法1.2.1桑叶粗多糖提取流程桑叶烘干，粉碎过筛，加入乙醚脱脂8 h，置于超净台中待乙醚挥发，置于一定温度热水中浸提一定时间，5 000 r/min离心10 min，吸取上清滤液。1.2.2桑叶多糖含量测定采用苯酚-硫酸[22-23]法测定桑叶中多糖含量。将D-无水葡萄糖作为标准品，加蒸馏水溶解成0.1 mg/L的标准品溶液，5支试管中分别吸取加入0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL标准品溶液，加蒸馏水补足至2 mL，加入5 mL浓硫酸溶液和1 mL 6%苯酚溶液，混匀，冷却，490 nm处测定吸光度。根据测得数据绘制标准曲线，横坐标为标准品浓度，纵坐标为吸光值，得到标准曲线方程为y=13.12x+0.008 1（R2=0.999 7）。桑叶中多糖含量的测定：吸取2 mL样品溶液，加入5 mL浓硫酸溶液和1 mL 6%的苯酚溶液，混匀，冷却，490 nm处测定吸光度，根据标准曲线方程计算桑叶多糖含量。多糖提取率=桑叶多糖质量桑叶粉末质量×100% (1)1.2.3单因素试验设计以1.2.1中桑叶多糖提取流程为基础，通过改变单一变量测定液料比、提取温度、提取时间对提取率的影响。设置初始工艺为液料比30 L/g、提取温度80 ℃、提取时间2 h。在提取温度80 ℃、提取时间2 h条件下，液料比分别设置10、20、30、40、50、60 L/g；在液料比30 L/g、提取时间2 h条件下，提取温度分别设置50、60、70、80、90、100 ℃；在液料比30 L/g、提取温度80 ℃条件下，提取时间分别设置2、3、4、5 h。每组设置3个平行试验，取平均值作为最终提取率。1.2.4正交试验设计以1.2.3中试验数据为依据，设计3因素3水平正交试验[24]。L9(34)正交试验因素水平设计见表1，采用SPSS 28中的多因素方差模块分析最佳工艺组合。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.T001表1L9（34）正交试验因素水平设计水平液料比（A）/(L/g)提取温度（B）/℃提取时间（C）/h12080223090334010041.2.5桑叶多糖体外抑菌活性在最佳工艺参数条件下测定桑叶多糖提取率，重复4次。采用牛津杯法[25]检测桑叶多糖体外抑菌活性，比较桑叶多糖对各类指示菌的抑制效果。受试菌选用沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，在无菌琼脂糖平板上涂布等量菌液，每个平板上放置2个无菌牛津杯，分别加入灭菌蒸馏水（空白对照）和桑叶多糖0.2 mL，每种菌3组平行。4 ℃平衡2 h，37 ℃恒温培养箱培养18 h。采用游标卡尺测量抑菌圈直径，抑菌活性以抑菌圈直径8.0 mm为界限，大于8.0 mm具备抑菌活性，直径越大，抑菌活性越高。采用二倍稀释法[26]检测最低抑菌浓度，配制0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 g/L桑叶多糖液，通过牛津杯法测定抑菌效果，通过抑菌圈直径判断最低抑菌浓度。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1液料比对桑叶多糖提取率的影响（见图1）由图1可知，随着液料比升高，桑叶多糖提取率呈先升高后降低的趋势，在液料比达到30 L/g时，桑叶多糖提取率最高，为5.75%。液料比为20、40 L/g时的桑叶多糖提取率仅次于液料比为30 L/g。因此，液料比选择20、30、40 L/g进行正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.F001图1液料比对桑叶多糖提取率的影响2.1.2提取温度对桑叶多糖提取率的影响（见图2）由图2可知，桑叶多糖提取率在90 ℃时达到最高，为6.17%。因此，提取温度选择80、90、100 ℃进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.F002图2提取温度对桑叶多糖提取率的影响2.1.3提取时间对桑叶多糖提取率的影响（见图3）由图3可知，随着提取时间的增加，桑叶多糖提取率呈先升高后降低的趋势，在提取时间为3 h时达到最高，为6.08%。随着提取时间的延长，环境中微生物会分解多糖，降低多糖含量。因此，提取时间选择2、3、4 h进行后续正交试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.F003图3提取时间对桑叶多糖提取率的影响2.2正交试验极差、方差结果（见表2、表3）由表2和表3可知，根据R值判断各因素对桑叶多糖提取的影响排序为提取温度（B）液料比（A）提取时间（C），提取桑叶多糖含量最高的工艺为A2B2C2。提取温度对桑叶多糖提取率具有显著影响（P0.05）。最优生产工艺参数组合为液料比30 L/g、提取温度90 ℃、提取时间3 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.T002表2正交试验极差分析结果项目A/(L/g)B/℃C/h多糖提取率/%1409046.1922010046.0734010026.164308045.985408035.736209036.327208025.3583010036.219309026.17k15.915.695.89k26.126.236.09k36.036.156.08R0.210.540.2010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.T003表3正交试验方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值误差0.02120.010模型0.48860.0817.8110.118A0.02220.0111.0640.484B0.44620.22321.4330.045C0.01920.0100.9360.517注：R²=0.959；P0.05表示影响显著。2.3最优工艺条件下桑叶多糖的提取率（见表4）在液料比30 L/g、提取温度90 ℃和提取时间3 h的最佳工艺条件下，提取桑叶中的多糖，重复3次。由表4可知，多糖提取率分别为6.62%、6.71%、6.75%，桑叶多糖平均提取率为6.69%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.T004表4最优工艺参数下的桑叶多糖提取率项目平行1平行2平行3平均值多糖提取率6.626.716.756.69%2.4桑叶多糖的体外抑菌效果2.4.1桑叶多糖体外对3种菌株的抑菌圈直径（见表5）由表5可知，金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌圈直径分别为9.22、11.74 mm，均大于8.0 mm，说明桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显抑制作用，但对沙门氏菌的抑菌作用相对较差。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.T005表5桑叶多糖体外对3种菌株的抑菌圈直径项目桑叶多糖无菌水沙门氏菌5.96±0.35—金黄色葡萄球菌9.22±0.52—大肠杆菌11.74±0.42—注：“—”表示无抑菌效果；下表同。mm2.4.2桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最低抑菌浓度（见表6）选取金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，梯度稀释桑叶多糖浓度，进一步研究其最低抑菌浓度。由表6可知，随着桑叶多糖的浓度升高，其抑菌作用增强，但金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的被抑制程度略有不同。桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的最低抑菌浓度均为2.0 g/L。但在桑叶多糖浓度为8.0 g/L条件下，桑叶多糖对大肠杆菌的抑制作用高于金黄色葡萄球菌，说明桑叶多糖对大肠杆菌的抑菌作用更强。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.014.T006表6桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的最小抑菌浓度桑叶多糖浓度/(g/L)金黄色葡萄球菌大肠杆菌0.5——1.0——2.0++4.0++++8.0+++++注：“+”“++”和“+++”分别表示抑菌圈直径在6~8、8~10、10 mm以上。3讨论本研究所用的热水浸提法的最优工艺组合为液料比30 L/g、提取温度90 ℃、提取时间3 h，在该工艺条件下桑叶多糖提取率高达6.69%。彭传友等[27]通过减压内部沸腾法提取桑叶多糖，采用响应面法优化提取参数，最佳提取工艺为体系压力降至285 mm Hg，乙醇体积分数、提取温度、提取时间和液料比分别为33%、73 ℃、22 min、24 mL/g，桑叶多糖提取率为4.90%。张华等[28]通过超声-微波协同提取桑叶多糖，发现最佳工艺组合为液料比25 mL/g、超声功率139 W、微波功率250 W、协同时间14 min，多糖提取率平均为5.19%，与上述研究结果相比，本试验得到的桑叶多糖提取率较高，表明提取方法可行。桑叶多糖具备抗菌性[29-30]。本研究结果显示，桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有明显抑制作用，抑菌圈直径分别为9.22、11.74 mm，桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌生长的最低抑菌浓度均为2.0 g/L；在桑叶多糖浓度为8.0 g/L条件下，桑叶多糖对大肠杆菌的抑制作用高于金黄色葡萄球菌，与孙伟等[29]的研究结果一致。以上研究表明，桑叶多糖具有较好的抑菌效果，可作为一种新型的饲用多糖应用于动物养殖。4结论本研究采用热水浸提法提取桑叶多糖，各因素对桑叶多糖提取率的影响排序为：提取温度液料比提取时间，最优提取工艺参数组合为液料比30 L/g、提取温度90 ℃、提取时间3 h。最优工艺条件下，桑叶多糖的平均提取率为6.69%。桑叶多糖对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌具有较好的抗菌活性，且对大肠杆菌的抑制效果更好。