分子印迹技术（molecular imprinting technique，MIT）是从仿生学的角度，基于“抗原和抗体”“酶和底物”的原理建立的，可合成特异性识别目标分子的分子印迹聚合物[1]。分子印迹聚合物对目标分子具有预定性、识别性及高选择性，可特异性识别模板或结构类似物[2-3]。与天然生物分子识别系统相比，分子印迹聚合物稳定性更高、抗恶劣环境能力更强、使用寿命更长，能够选择性识别复杂样品中含有结构相似和相关化学物质的目标物，广泛应用于饲料及动物食品中兽药残留的安全分析、环境监测等[4]。大环内酯类抗生素是畜牧业中常用抗生素之一[5-7]，允许在动物疾病治疗中使用的大环内酯类抗生素有红霉素、替米考星和泰乐菌素等[8-9]，主要用于防治畜禽呼吸道、胃肠道等感染[10-12]。研究表明，兽药残留在组织中消除时间较长[13-16]，长期不规范使用会造成药物残留过高，进而引起皮肤过敏和胃肠系统反应，造成抗生素有效性降低[17-18]和环境污染[19]等问题。因此，对动物源性食品中大环内酯类的检测及监测十分重要。近年来，固相萃取技术应用在大环内酯类检测预处理方面，尤其是分子印迹技术，更提高了该类药物检测的高效性。分子印迹固相萃取（molecularly imprinted solid phase extraction，MISPE）是基于传统固相萃取，以分子印迹聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）为吸附剂发展而来，在样品预处理方面主要用于目标分析物的浓缩和净化[20-21]。根据载体的不同又分为普通MISPE和磁性分子印迹固相萃取（magnetic molecular imprinting solid phase extraction，MMISPE）。MISPE和MMISPE既具有固相萃取回收率高、溶剂消耗低的优点，又具有分子印迹聚合物的特定选择性和识别能力[22]。本文针对MISPE和MMISPE在大环内酯类兽药检测预处理技术中的应用进行介绍，通过对MISPE和MMISPE应用中的分子印迹聚合物合成方法、吸附效果、富集效果等的归纳总结，并结合各种检测方法验证前处理效果，为优化大环内酯类抗生素残留检测前处理方法提供参考。1分子印迹固相萃取分子印迹聚合物是通过分子印迹技术对特定目标分子（模板分子）及其结构类似物具有特异性识别和选择性吸附的聚合物，在合成过程中因模板的存在而形成，具有分子识别能力、制备简单、选择性高、化学稳定性好、可在恶劣环境中使用等特点[23-24]。MISPE是将分子印迹聚合物作为填充材料，结合色谱分离技术对复杂基质中的痕量或微量目标分析物进行提取和净化的一种技术，广泛应用于动物产品和环境中的大环内酯类抗生素检测预处理方面[25]。宋彬等[26]以红霉素（erythromycin，ERY）为模板，采用沉淀聚合法制备的分子印迹固相萃取柱，经扫描电镜表征和测定，对ERY具有特异性吸附作用；使用该固相萃取柱对猪肉中ERY进行提取和净化，并结合高效液相色谱进行检测，对猪肉样品中不同添加水平ERY的加标回收率为95.2%~104.2%，相对标准偏差小于5%，检出限为0.2 mg/kg，为猪肉等动物源性食品中ERY残留的日常监控提供新方法。ZHOU等[27]以螺旋霉素为模板，制备了对阿奇霉素具有高选择性的分子印迹聚合物整体微柱，建立的印迹整体柱-高效液相色谱-串联质谱法测定猪肉中阿奇霉素残留量的方法；猪肉样品在最佳的整体微柱条件下净化，在多反应监测模式下进行液-质联用分析，在0.5、1.0、10.0 g/kg共3个添加水平下，猪肉样品中阿奇霉素的平均回收率在85.8%~96.5%，检出限为0.03 μg/kg，定量限为0.1 μg/kg，适用于食用动物组织中阿奇霉及其类似物的常规分析和监测。ZHANG等[28]以红霉素为模板合成的多壁碳纳米管分子印迹聚合物，经透射电子显微镜、扫描电子显微镜和傅里叶红外光谱表征及吸附试验，发现多壁碳纳米管分子印迹聚合物对红霉素具有较高的选择性，可以选择性地从鸡肉样品中提取红霉素，回收率在85.3%~95.8%，可用于鸡肉中红霉素的预浓缩和纯化。CAÑADAS等[29]采用非共价印迹法制备大环内酯类抗生素选择性结合的分子印迹膜，以红霉素和螺旋霉素为分子模板，对纳米功能化分子印迹膜的形貌和吸附性能进行表征；对影响MIMSPE方法的参数进行了优化，并进行高效液相色谱法分析，平均回收率分别为86.14%和34.73%，相对标准偏差均小于6%，提供了一种快速、可重复、简单的在线固相萃取程序。MISPE不仅可以对动物产品以及环境中单一的大环内酯类抗生素进行提取和净化，还可以对结构相似的一类抗生素进行同步预处理，为多种目标物的同步分析奠定基础。JI等[30]以螺旋霉素为模板，制备了中空多孔分子印迹聚合物，可对大环内酯类药物进行分散固相萃取，萃取的结合容量（120 μmol/g）及时间（20 min）均优于传统材料，能够用于从加标蜂蜜中提取阿奇霉素、螺旋霉素等大环内酯类药物进行同步分析，方法的检出限在3~17 ng/kg，为蜂蜜样品中痕量大环内酯类兽药残留的分析提供了一种有效的前处理技术。LIU等[31]在木质针尖表面修饰了一层分子印迹聚合物涂层制备固相微萃取探针，可直接用于富集复杂样品中的痕量大环内酯类药物，对饮用水、蜂蜜和牛奶中五种被研究的大环内酯类抗生素的富集倍数分别为244~1 604、72~370、12~82倍；在常压条件下可直接进行质谱分析，检出限分别为0.003~0.050、1.1~5.1、1.9~15.8 ng/g，涂有MIP涂层的木尖再生性能良好，可多次回收使用；与传统的萃取材料相比，分子印迹整体萃取柱保留能力和耐久性更好，为检测饮用水和复杂基质中的痕量兽药残留提供了一种新方法。SONG等[32]以罗红霉素作为虚拟模板采用原位聚合法制备的选择性微萃取分子印迹整体萃取柱，与传统的C18和HLB相比，分子印迹整体萃取柱具有更好的保持能力和耐用性；对动物肌肉中大环内酯类进行选择性微量提取后用液相色谱-串联质谱进行测定，克拉霉素、红霉素、阿奇霉素等六种大环内酯类化合物的加样回收率为76.1%~92.8%，相对标准偏差小于10.4%，表明该方法在动物性食品中大环内酯类兽药残留的痕量分析中潜力很大。宋旭琴等[33]以泰乐菌素为模板，以本体聚合法制备MISPE小柱，结合液相色谱-串联质谱法对猪、牛及鸡肌肉组织中十种大环内酯类药物残留进行分析，制备的MISPE小柱净化及富集效果均优于传统萃取柱，在1、5、20 g/kg添加浓度下，10种大环内酯类药物在肌肉组织的回收率为60.7%~100.3%，检测限为0.1~0.4 g/kg，定量限为0.3~1.0 g/kg，表明该方法可应用于猪、牛及鸡肌肉组织中等复杂基质中大环内酯类兽药残留的预处理。SONG等[34]采用非共价本体聚合法制备了6种红霉素分子印迹聚合物，优化MISPE后，该分子印迹聚合物能够识别与其他大环内酯类化合物有中等交叉反应的ERY；在1 000、500、250 μg/g时，合成的分子印迹聚合物的回收率分别为79%、86%和90%，相对标准偏差均在8%以下，表明所获得的分子印迹聚合物作为特定的固相萃取吸附剂在实际应用中具有很大的潜力。MISPE技术的重点是分子印迹聚合物的合成与制备，为了在最短的吸附时间达到吸附平衡，需要对吸附时间、样品的离子强度、样品的pH值、吸附剂的用量等进行优化[35]。SONG等[36]采用沉淀聚合法合成特异性大环内酯类分子印迹聚合物，对阿奇霉素具有最大的吸附容量（54.1 mg/g）和最高的印迹因子（2.4），可同步对阿奇霉素、克拉霉素和ERY等7种大环内酯类药物在5、10、25、100 μg/kg的加标水平下，经液相色谱-串联质谱测定7种大环内酯类药物的平均回收率为68.6%~95.5%，检测限和定量限分别为0.2~0.5、0.5~2.0 μg/kg，制备的MIP微球对7种大环内酯类兽药具有较快的吸附动力学和较好的印迹效果。洪月琴[37]采用沉淀聚合法合成红霉素和泰乐菌素的复合模板分子印迹固相萃取柱，与场放大进样胶束电动毛细管色谱法相结合用于牛奶中替米考星、ERY和罗红霉素等大环内酯类药物检测，富集倍数达2 825~4 540倍，加标回收率为75.3%~94.2%，检出限可达0.3~0.8 μg/L，均高于传统萃取柱，可用于牛奶样品中5种大环内酯类兽药的富集和净化前处理。李爱芸等[38]以替米考星为模板合成分子印迹聚合物制成固相萃取枪头，用于蜂蜜中大环内酯类药物的富集，采用高效液相色谱法进行分析，泰乐菌素等4种大环内酯类药物在0.125~25.000 mg/kg范围内线性关系良好，检出限和定量限分别为14.2~71.6、47.4~238.5 μg/kg，回收率为90%~110%，可用于蜂蜜中大环内酯类兽药残留的痕量抗生素的检测。MAYOR等[39]采用非共价本体聚合技术合成的与螺旋霉素具有互补反应位点的分子印迹聚合物为吸附剂，可特异性识别螺旋霉素，且与所研究的其他大环内酯类化合物无交叉反应；应用该方法对高、中、低3个加标水平下牛奶样品中的螺旋霉素进行提取和净化，并用液相色谱进行检测，测定的平均加标回收率均高于90%，定量限为24.1 µg/kg，可用于羊奶中螺旋霉素的选择性测定。根据待检测样品中目标化合物合成的分子印迹聚合物作为吸附剂的分子印迹固相萃取预处理技术，已从对单一化合物的提取、净化、萃取发展为多种目标物同步分析的预处理，在大环内酯类兽药残留监测方面具有良好的应用前景。虽然分子印迹聚合物简化了制备流程，缩短了制备时间，具有稳定性更好和可重复使用等特点[40]，但目前多使用传统分子印迹合成方法，且容量较低，某些情况下直接将目的化合物预浓缩到分子印迹聚合物上，很难达到所需的检出限[41]。而有些分子聚合物黏度较高时使包裹在聚合物中的目标分子很难洗脱，导致选择性和专一性降低[42]，在实际分析中限制其广泛应用。2磁性分子印迹固相萃取传统的分子印迹材料通常存在模板分子传质阻力大、固液分离复杂、难回收、需要过滤离心等问题，后处理问题复杂限制其发展及应用[43]。以磁性材料为吸附剂的MMISPE因其易回收、可直接在待测样品中吸附目标物、无须过滤离心等烦琐步骤[44]等优点，为分子印迹固相萃取在大环内酯类兽药残留的检测及监测提供了新思路[45]。MMISPE是将磁性物质结合分子印迹聚合物，其本质是选择性识别和磁分离结合在一起进行磁分离的样品预处理技术[46]。MMISP技术因其选择性高、稳定性好、低毒性、磁性材料可重复利用，成为饲料、食品、环境和生物样品中分析物质预富集和提取的最常用的样品预处理方法之一[47-48]。MMISP技术在大环内酯类抗生素中的应用包括磁性分子印迹聚合物的制备、磁性分子印迹聚合物的制备及应用。在磁性分子印迹聚合物的制备方面，侯玲梅等[49]采用本体聚合法制备的磁红霉素分子印迹合物和光降解红霉素分子印迹合物，经表征选择性优于其他抗生素，提高了印迹材料ERY去除性能。FAN等[50]制备的用于选择性萃取大环内酯类抗生素的核卫星结构磁性纳米吸附剂，经透射电子显微镜、扫描电子显微镜等表征，在使用高效液相色谱串联质谱方法定量之前，将其用作磁性分散固相萃取吸附剂，用于从复杂的食品基质中富集痕量大环内酯类抗生素；在牛奶样品中大环内酯类化合物的验证结果显示，阿奇霉素、螺旋霉素等的检出限为0.012~0.065 µg/kg；纳米复合材料显示出优异的磁性、高吸附容量（103.6 µmol/g）和与大环内酯类抗生素的快速动力学结合（20 min）的多重优势。研究表明，一种大环内酯类抗生素分子印迹磁性金属有机骨架复合材料的吸附选择性好，可快速吸附ERY、克拉霉素等，还具有超顺磁性，能实现快速的固液分离，可重复利用至少5次，结合固相萃取-高效液相色谱法可用于复杂环境水样中大环内酯类抗生素的分离和检测[51]。磁性分子印迹聚合物在大环内酯类兽药的预处理及检测中发展迅速，检出限已达到了微克水平，见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.032.T001表1磁性分子印迹聚合物在大环内酯类兽药检测中的应用模板分子合成方法检测样品检测兽药品种检出限文献来源红霉素表面分子印迹法猪肉、鱼和虾样品、饲料红霉素、竹桃霉素等6种大环内酯类0.015~0.200 μg/gZHOU等[52]螺旋霉素表面分子印迹法蜂蜜螺旋霉素、交沙霉素、替米考星、酒石酸泰乐菌素0.53~2.75 μg/L孙佳佳等[53]替米考星表面分子印迹法奶粉替米考星、螺旋霉素、交沙霉素、泰乐菌素0.58~1.36 μg/kg夏张悦怿等[54]红霉素表面分子印迹法肉制品红霉素1.0×10-10 mol/L龙芳[55]ZHOU等[52]采用表面分子印迹技术制备磁性分子印迹聚合物，建立磁固相萃取方法，可同时选择性分离猪肉、鱼类和虾类样品中的红霉素、竹桃霉素等6种大环内酯类抗生素，不同添加浓度下萃取回收率可达89.1%，相较其他以分子印迹聚合物为识别元素的分析方法，该方法对猪肉中的ERY或饲料样品中的替米考星的检测灵敏度为0.015~0.200 µg/g，与其他检测方法的猪肉中的ERY 10 µg/g或饲料样品中的替米考星0.35 µg/g的检测限相比要低得多。孙佳佳等[53]以螺旋霉素为模板合成的分子印迹磁性纳米吸附剂，对螺旋霉素等四种大环内酯类药物富集效果良好，选择性优于常规吸附剂，富集倍数为72~758倍，结合高效液相色谱分析，检出限为0.53~2.75 µg/L，定量限为1.78~9.16 µg/L，用于蜂蜜中痕量大环内酯类兽药样品预处理得到理想结果，可进一步在其他基质样品检测中推广应用。夏张悦怿等[54]制备的磁性表面分子印迹聚合物吸附剂，用于奶粉中替米考星、螺旋霉素、交沙霉素、泰乐菌素富集后经液相色谱检测，对4种模型大环内酯类药物的富集倍数与直接进样相比提高了212~675倍，吸附时间缩短为30 min，检出限和定量限分别为0.58~1.36、1.92~4.55 µg/kg，可应用于其他样品中兽药痕量残留的前处理。龙芳[55]以ERY为模板分子采用表面印迹技术研制的印迹复合材料，分别作为固相萃取剂和电化学传感器，建立的一种肉制品中痕量ERY MMISPE-印迹电化学传感器联用的分析方法，可将样品中ERY富集浓度提高9~12倍，最低检出限为1.0×10-10 mol/L，实现了快速从复杂环境中分离富集检测痕量红霉素，应用前景良好。与传统的固相萃取相比，MMISPE以磁性材料作为固相萃取剂具有选择性好、吸附时间短、富集效果好、操作简单、分离快速等优点，不需要像传统的固相萃取那样被包装到设备中，克服了传统的固相萃取柱堵塞的缺点[56-57]，在兽药残留分析中具有很大的应用潜力。3展望分子印迹技术的固相萃取作为新型的样品预处理技术，在饲料等样品中大环内酯类兽药残留的分析应用方面具有广阔的前景。大环内酯类药物在样品中通常为痕量、超痕量水平，样品基质复杂，使用分子印迹固相萃取技术对其进行提取、净化和分离，再结合液相色谱、质谱等现代分析仪器进行检测提高了对该类药物的检测水平，尤其在检测限、检测回收率及多种药物同步检测方面有了明显的改善作用。但是，多模板分子印迹聚合物制备、多个目标分子同时识别的参数优化等技术，尤其是对于单一模板分子印迹聚合物对多种目标分析物提取净化的参数优化技术还有待提高。同时，分子印迹聚合物的制备及模板的选择也限制其广泛应用。此外，分子印迹固相萃取技术在饲料分析中的应用还有待进一步开发，尤其对于基质复杂的饲料样品，其分子印迹聚合物的制备、模板选择及净化参数的优化等都是未来研究开发中需要解决的关键问题。