滩羊是宁夏地区经过长期自然选择和人工选育逐渐形成的优良地方畜种，因其肉质鲜美、营养丰富而闻名。饲粮组成、羊的品种、饲养方式等因素均会影响羊肉中脂肪酸组成及含量，从而影响羊肉品质[1-4]。饲养方式会改变羊体组织脂肪沉积和肌肉中脂肪酸组成[5-7]。近年来，转录组测序技术发展较快，常在一些功能基因的挖掘中应用。王燕燕等[8]使用转录组学技术对陶湖杂交F1代与萨湖杂交F1代羔羊背最长肌进行转录组测序分析，筛选出552个差异表达基因，其中385个上调基因，167个下调基因，筛选出硬脂酰辅酶A去饱和酶（SCD、LIPG）、内皮脂肪酶基因（LPL）可作为羔羊肉质性状候选基因。韩信嵘等[9]利用转录组学技术分析安格斯牛和西门塔尔牛背膘组织中与脂肪沉积有关的差异表达基因，筛选到dickkopf样顶体蛋白1（DKKL1）、乙酰辅酶A羧化酶β（ACACB）和前列腺素内过氧化物合酶2（PTGS2）与脂肪沉积相关。本试验为了探究舍饲条件下不同月龄滩羊肌间脂肪沉积的内在联系及相关表达基因，采用转录组学对舍饲条件下滩羊的背最长肌及股二头肌（BF）脂肪代谢相关的差异表达基因进行分析，明确影响脂肪代谢的重要通路，挖掘滩羊在舍饲条件下不同部位脂肪代谢的相关基因。1材料与方法1.1试验动物及饲养管理滩羊均来自宁夏回族自治区。选择体重接近、健康的2月龄舍饲滩羊12只。滩羊圈舍棚面积为50.4 m2（8.4 m×6.0 m），棚高2.5 m，露天活动区面积为56 m2（7.0 m×8.0 m），圈舍总面积106.4 m2。滩羊饲喂全混合饲粮，每日早晚定时饲喂，一日两次。基础饲粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.T001表1基础饲粮组成及营养水平（干物质基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米秸秆29.10消化能/(MJ/kg)10.25柠条10.00粗蛋白/%13.49苜蓿干草20.00中性洗涤纤维/%42.43玉米22.15酸性洗涤纤维/%24.15豆粕12.00钙/%0.44麸皮3.00磷/%0.38糖蜜2.00碳酸氢钙0.85食盐0.40预混料0.50注：1.每千克预混料为饲粮提供：VA 150 000 IU、VD 50 000 IU、VE 1 000 IU、烟酸200 mg、泛酸100 mg、生物素10 mg、Fe 1 600 mg、Cu 250 mg、Mn 2 650 mg、Zn 1 000 mg、I 15 mg、Se 7.5 mg、Co 7.5 mg。2.营养水平中消化能为计算值，其余均为实测值。1.2样品采集分别于2月龄和6月龄选取体重相近的3只滩羊进行屠宰，每组取股二头肌和背最长肌组织样品。将2月龄和6月龄股二头肌分别编号为：BFR2（BFR21、BFR22、BFR23）和BFR6（BFR61、BFR62、BFR63）。将2月龄和6月龄背最长肌分别编号为：LDR2（LDR21、LDR22、LDR23）和LDR6（LDR61、LDR62、LDR63），每个样品≥3 g，所有样品均于-80 ℃保存。1.3RNA的提取与建库测序本试验参考文献[10]的方法，从样品组织中提取RNA。为保证文库质量，在文库构建完成后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量（文库有效浓度高于2 nmol/L）。库检合格后使用Illumina NovaSeq 6000高通量测序平台对文库进行测序。整个过程均由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。1.4测序结果的质控为了保证后续数据分析的质量及可靠性，对建库测序后获得的原始数据中包含少量带有测序接头或测序质量较低的reads进行过滤。1.5差异表达基因分析采用Subread软件对基因进行表达水平的定量，定量完成后对其表达数据进行统计学分析。选用DESeq2[11]按照|log2（FoldChange）|矫正后的P值0.05的标准进行基因表达差异显著性分析。1.6差异表达基因功能富集本试验以矫正后的P值0.05作为显著性富集的阈值，使用clusterProfiler软件对差异表达基因集进行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。2结果与分析2.1测序数据及质量评估结果（见表2）由表2可知，上机测序后数据经过过滤、错误率和GC含量分布检查，共获得685 663 122条有效序列，有效碱基的数量为102.81 G，错误率在0.02%~0.03%，有效碱基中G与C占4种碱基的百分比为52.60%~55.00%，Q20在97.58%~98.12%之间，Q30在93.27%~94.52%之间。研究表明，测序结果质量可靠，可用于后续的试验分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.T002表2测序数据质量评估结果样品名原始序列/条有效序列/条有效碱基/G错误率/%Q20/%Q30/%GC-pct/%LDR2163 288 84862 373 2649.360.0397.5893.2754.38LDR2252 560 63451 671 5627.700.0297.5993.3054.08LDR2359 589 18858 706 1288.810.0297.6593.5053.99LDR6158 135 00857 418 3768.610.0297.9394.1453.86LDR6252 723 52451 799 5407.770.0397.9694.2554.57LDR6363 626 13662 599 7449.390.0297.9894.2552.65BFR2151 331 50850 872 2167.630.0397.7893.7554.52BFR2268 210 42067 518 57210.130.0397.8093.7754.47BFR2357 896 06057 190 9068.580.0397.8593.9452.60BFR6157 984 69257 109 1548.570.0398.0594.3853.48BFR6251 571 02450 893 1307.630.0398.0694.5152.74BFR6358 221 19457 510 5308.630.0398.1294.5255.002.2基因分布及差异分析由于测序深度和基因长度的影响，RNA-seq的基因表达值一般是用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript sequence per Millions base pairs sequenced）对测序深度和基因长度进行了校正。盒形图展示了不同样本基因表达水平的分布情况（见图1）。由图1可知，不同月龄的滩羊背最长肌组织样品中基因的表达水平具有差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.F001图1所有样品表达量盒形图在基因表达定量完成后，将每个组合的差异基因按照DESeq2 padj0.05 |log2FoldChange|0的标准进行筛选，结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.T003表3差异基因统计项目全部上调下调BFR6 vs BFR21466977LDR6 vs LDR21 418774644由表3可知，6月龄与2月龄的股二头肌的差异基因共有146个，其中上调的差异基因有69个，下调的差异基因有77个。6月龄与2月龄的背最长肌的差异基因共有1 418个，其中上调的差异基因有774个，下调的差异基因有644个。本试验对差异基因进行聚类分析（见图2），颜色由蓝色到红色的颜色变化代表基因表达量从低到高的变化。由图2可知，本研究所用样本在同一月龄的生物学样本聚类情况良好，说明可用于下一步分析。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.F002图26月龄与2月龄滩羊羔羊股二头肌及背最长肌所有差异基因的聚类分析2.3差异基因的GO富集分析（见图3）由图3（a）可知，6月龄与2月龄滩羊羔羊的股二头肌（BFR6 vs BFR2）差异表达基因富集在40个GO条目中，主要体现在内皮细胞凋亡过程的调节、羧酸代谢过程及上皮细胞凋亡过程的负向调节等生物过程中。由图3（b）可知，背最长肌（LDR6 vs LDR2）的差异表达基因富集在250个GO条目中，主要体现在细胞-细胞黏附、单个生物体的细胞-细胞黏附、单个生物体的细胞黏附、细胞-细胞黏附的正向调节、细胞黏附的调节及对T细胞激活的调节等。图3差异基因的GO富集分析注：Padj为多重假设检验校正后的P值；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.F3a1（a）BFR6 vs BFR2 （b）LDR6 vs LDR22.4部分KEGG通路与差异表达基因分析（见表4和图4）通过对差异基因集进行KEGG通路富集分析，可以进一步确定基因的生物学功能。通过显著性富集的通路分析可以了解差异基因参与的主要代谢途径和信号转导途径。本试验中，与不同月龄舍饲滩羊肌内脂肪沉积密切相关的通路有PPAR信号传导途径，脂肪细胞因子信号通路及脂肪酸代谢通路（见表4）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.T004表4部分KEGG通路与差异表达基因分析项目KEGG通路名称差异表达基因BFR6 vs BFR2PPAR信号传导途径脂蛋白1（PLIN1）、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶（PCK1）、肉碱棕榈酰转移酶1A（CPT1A）、含脂联素、C1Q和胶原结构域（ADIPOQ）、硬脂酰辅酶A脱饱和酶（SCD）脂肪细胞因子信号通路前体蛋白阿黑皮素原（POMC）、PCK1、CPT1A、含脂联素、C1Q和胶原结构域（ADIPOQ）LDR6 vs LDR2PPAR信号传导途径脂蛋白5（PLIN5）、载脂蛋白A2（APOA2）、脂蛋白2（PLIN2）、脂肪酸结合蛋白3（FABP3）、CPT1A、脂肪酸结合蛋白1（FABP1）、烯酰辅酶A水合酶和3-羟酰基辅酶A脱氢酶（EHHADH）、PLIN1、载脂蛋白C3（APOC3）、脂肪酸结合蛋白5（FABP5）脂肪酸代谢乙酰辅酶A羧化酶α（ACACA）、脂肪酸去饱和酶1（FADS1）、3-羟酰辅酶A-脱水酶-1（HACD1）、CPT1A、EHHADH、极长链酰基辅酶A脱氢酶（ACADVL）、羟基类固醇17-β脱氢酶12（HSD17B12）、羟酰辅酶A脱氢酶三功能多酶复合物亚基α（HADHA）分别选取6月龄与2月龄滩羊羔羊股二头肌和背最长肌差异表达基因显著的20个KEGG通路绘制散点图，结果见图4。图4KEGG富集的前20条通路10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.012.F4a1（a）BFR6 vs BER2 （b）LDR6 vs LDR2由图4（a）可知，6月龄与2月龄股二头肌（BFR6 vs BFR2）的差异表达基因显著富集在4个通路中，其中最显著的是PPAR信号通路。由图4（b）可知，背最长肌中（LDR6 vs LDR2）的差异表达基因富集在18个通路中，其中与脂肪代谢相关的通路有PPAR信号传导通路及脂肪酸代谢。3讨论3.1不同月龄滩羊股二头肌脂肪沉积相关差异表达基因分析本试验通过GO富集分析6月龄与2月龄滩羊羔羊股二头肌的差异表达基因，发现差异基因主要富集在内皮细胞凋亡过程的调节，单羧酸代谢过程等生物过程方面。ANGPTL4基因是与血管生成、脂类代谢、葡萄糖代谢、胰岛素敏感性密切相关的分泌性蛋白质因子[12]，具有促进脂解和脂肪酸氧化分解、减少脂肪沉积并刺激脂肪动用的作用[13]。徐畅等[14]研究表明，ANGPTL4基因影响延边黄牛的肌内脂肪沉积。本试验发现，6月龄与2月龄滩羊羔羊股二头肌中ANGPTL4基因上调表达，这与上述研究相符，表明ANGPTL4基因与滩羊羔羊股二头肌脂肪代谢密切相关。FASN是催化哺乳动物脂肪酸合成的一种结合酶[15]。骆金红等[16]研究表明，FASN基因在贵州黑山羊各肌肉组织中与背最长肌、肱三头肌、臂股二头肌肌内脂肪（IMF）含量呈负相关。本试验数据分析，随着滩羊羔羊月龄增加，FASN基因在股二头肌中呈下调状态，与上述试验结果一致，说明FASN基因与滩羊羔羊股二头肌脂肪代谢密切相关。本试验通过KEGG富集分析股二头肌的差异表达基因富集的通路中，与脂肪代谢相关的通路为PPAR信号通路及脂肪细胞因子信号通路。梁计峻等[17]研究表明，CPT1A基因表达量与山羊各肌肉组织IMF含量均呈显著正相关，可能在IMF沉积过程中具有重要调控作用。屠云洁等[18]研究证实了CPT1A基因在5、7、9周龄“花山麻鸡”腿肌的表达量显著高于胚胎期，CPT1A基因在“花山麻鸡”腿肌的表达量呈上升趋势。以上研究表明，CPT1A基因的表达量随着动物机体年龄的增长而增加。本试验表明，CPT1A基因在PPAR通路中显著上调，与上述试验结果相符，表明随着滩羊羔羊月龄的增加，CPT1A基因参与了脂肪代谢，可能与滩羊羔羊股二头肌的IMF含量密切相关。3.2不同月龄滩羊背最长肌脂肪沉积相关差异表达基因分析本试验通过GO富集分析发现，背最长肌的差异表达基因主要富集细胞-细胞黏附、单个生物体的细胞-细胞黏附及单个生物体的细胞黏附生物过程中。LEP在能量平衡和体重控制中起着关键作用。研究表明，LEP在调节牛的脂肪沉积中起重要作用[19-20]。STACHOWIAK等[21]验证了LEP基因在猪的脂肪沉积中起着关键作用。刘晓妍等[22]研究表明，在牛的脂肪组织中存在大量LEP基因，其对脂肪沉积有着重要的作用。本试验中，LEP基因随着滩羊羔羊月龄的增长呈下调趋势，与上述的研究基本一致。随着滩羊羔羊月龄的增加，LEP基因表达量下降，导致能量消耗减弱，有利于脂肪沉积，表明LEP基因可能在滩羊羔羊背最长肌脂代谢中有着重要作用。IGF2是胰岛素类家族多肽生长因子的成员，参与了生物机体的生长和发育。武建亮等[23]研究表明了IGF2基因在猪的脂肪沉积中起重要作用，可作为脂肪沉积的候选基因应用与标记辅助选择。王彬彬等[24]研究发现，IGF2基因在猪的肌内脂肪沉积中起着重要作用。牛伟萍等[25]研究发现，IGF2基因在牛的脂肪沉积和肌肉发育中起作用，且IGF2基因的多样性可能直接影响草原红牛的肉质性状。本试验表明，随着月龄的增长，滩羊肌肉IGF2基因呈下降趋势，与IGF基因随着年龄增长呈下降趋势[26]的结果相同，表明IGF2基因可能参与了滩羊羔羊背最长肌的脂肪代谢。本试验通过KEGG富集分析背最长肌的差异表达基因富集的通路中发现，与脂肪代谢相关的通路为PPAR信号通路及脂肪酸代谢通路。FABP3基因作为调控IMF的优势基因，受到了广泛关注[27]。邝良德等[28]研究发现，FABP3基因与九龙牦牛的背最长肌的IMF显著相关。本试验中，随着滩羊羔羊月龄的增加FABP3基因呈上调趋势，与前人发现FABP3基因表达量随着动物年龄的增加而增加的结果相一致[29-30]，表明FABP3基因与滩羊羔羊背最长肌的脂肪代谢密切相关。4结论通过对差异表达基因的GO功能富集及KEGG通路富集，舍饲条件下6月龄与2月龄滩羊羔羊股二头肌差异表达基因主要富集在内皮细胞凋亡过程的调节、单羧酸代谢过程及PPAR信号通路、脂肪细胞因子信号通路中，与脂肪代谢密切相关的ANGPTL4、FASN及CPT1A基因差异表达。舍饲条件下6月龄与2月龄滩羊羔羊背最长肌差异表达基因主要富集在细胞-细胞黏附、单个生物体的细胞-细胞黏附、单个生物体的细胞黏附、PPAR信号通路及脂肪酸代谢通路中，与脂肪代谢密切相关的LEP、IGF2、FABP3基因差异表达。