农副产品在饲料中的应用已成为循环经济的重要组成部分。纤维素酶作为绿色安全添加剂可有效提高饲料的转化率和动物的生产性能，应用前景潜力巨大[1]。纤维素酶是由葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶组成的复合酶系[2]。其中，葡聚糖外切酶从纤维素链末端依次水解糖苷键，是纤维素酶系统的重要组成部分，在纤维素水解过程中发挥重要作用[3]。耐热纤维素酶因其优越的热稳定性、底物专一性以及催化活性，具有重要的应用研究价值[4]。热纤梭菌（Clostridium thermocellum）是严格厌氧的嗜热细菌，能够分泌纤维小体[5]，其中最丰富的催化组分是葡聚糖外切酶CelS[6]，在降解纤维素中起关键作用[7-8]。因此，利用基因工程高效生产CelS，可有效解决天然微生物因不易大规模发酵培养而导致产酶量较低的问题。LIU等[9]利用枯草芽孢杆菌表达系统实现了CelS的分泌表达。LIU等[10]通过定向改造纤维小体，分离纯化获得了原位CelS。然而，在大肠杆菌表达系统中，CelS主要以无活性的包涵体形式表达，需经变性、复性等复杂操作重折叠为活性CelS[11-12]，或分泌至周质空间获得有限的表达量[13]，导致其在饲料中的应用存在瓶颈。本研究基于CelS的序列信息，经生物信息学分析和密码子优化，利用大肠杆菌表达系统高效表达CelS，通过自诱导表达方式将可溶CelS和包涵体CelS分别经分离纯化和变性复性后，进行酶学特性分析，并与海栖热袍菌（Thermotoga maritima）葡聚糖内切酶EG12B复配，协同水解玉米秸秆，为复合纤维素酶的开发及其在饲料行业中的应用奠定基础。1材料与方法1.1试验材料菌株Escherichia coli DH5α、E. coli BL21（DE3）、E. coli BL21（DE3）/pET28-EG12B、质粒pET-22a为本实验室保存。Q5超保真DNA聚合酶、限制性内切酶、DNA连接酶购自NEB公司。PCR产物纯化试剂盒、胶回收纯化试剂盒、质粒提取试剂盒购自BIOER公司。Mix DNA聚合酶和DNA Marker购自Novoprotein公司。预染蛋白Marker购自Thermo公司和上海生工生物工程有限公司。结晶纤维素PH-101（Avicel）购自Sigma公司。无定形纤维素（phosphoric acid-swollen cellulose，PASC）参照WANG等方法制备[11]。玉米秸秆（corn straw，CS）取自当地农家，经60 ℃烘24 h，裁切成小段，于固体粉碎机中粉碎后，过60目筛备用。Ni-NTA层析介质和层析柱购自GE公司。异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、氨苄西林购于上海生工生物工程有限公司。1.2菌体培养LB培养基：1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、1%NaCl，调pH值至7.0；固体培养基再加入2.0%琼脂，121 ℃灭菌20 min。自诱导培养基：底液（1%胰蛋白胨、0.5%酵母粉、50 mmol/L NH4Cl、25 mmol/L Na2HPO4、25 mmol/L KH2PO4、5 mmol/L Na2SO4、2 mmol/L MgSO4，调pH值至7.0）；糖液（0.5%甘油、0.05%葡萄糖、0.2%乳糖），分别121 ℃灭菌20 min后再混合。1.3目的基因筛选和优化登录UniProt（https://www.uniprot.org/），下载CelS的氨基酸序列（登录号：P0C2S5）。利用SignalP 6.0（https://services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）分析CelS的氨基酸序列，预测信号肽区域及切割位点[14]。利用ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析CelS的理化参数。将成熟肽基因序列送至通用生物系统有限公司，利用Biology软件进行密码子优化及全基因合成后，插入质粒pET-22b的BamHⅠ~XhoⅠ中，获得重组质粒pET22-CelS。1.4重组质粒的转化及蛋白诱导表达条件优化将重组质粒pET22-CelS转化至表达宿主E. coli BL21 (DE3)中，挑取单菌落接种于氨苄抗性LB培养液中，37 ℃振荡培养至OD600 nm值达0.6~0.8时，添加0.1~0.5 mmol/L IPTG，分别于15、20、25 ℃条件下诱导48、36、24 h。挑取单菌落接种于氨苄抗性自诱导培养基中，分别在15、20、25 ℃自诱导培养60、48、24 h。离心收集菌体，经生理盐水洗涤3次后，Tris-HCl缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl，pH值8.0）重悬菌体，低温超高压（JN-02C低温超高压连续流细胞破碎仪，广州聚能纳米生物科技股份有限公司）进行细胞破碎获得全细胞蛋白，4 ℃、12 000 r/min离心20 min，分别收集胞内上清液和沉淀，进行SDS-PAGE检测。BandScan软件分析目的蛋白表达水平和可溶蛋白比例。1.5可溶蛋白的分离纯化细胞破碎上清液经0.22 µm水系微孔滤膜过滤后，上样至镍离子预装层析柱（HisTrap HP，GE公司），咪唑阶段洗脱分部收集洗脱液，经SDS-PAGE检测后，70 ℃热处理30 min，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，取上清液透析过夜，获得纯化酶液，Nanodrop 2000测定蛋白浓度。1.6包涵体的变性及复性细胞破碎沉淀充分重悬于预冷洗涤液（20 mmol/L Tris-HCl、2% TritonX-100、0.5 mol/L NaCl、2 mol/L尿素，pH值 8.0）中洗涤2次。洗涤后沉淀重悬于预冷变性液（20 mmol/L Tris-HCl、2% TritonX-100、0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素、0.2 mmol/L DTT，pH值8.0）中，待充分溶解后，4 ℃、12 000 r/min离心30 min，将上清液经0.22 μm水系微孔滤膜过滤后，依次置于含6、4、2 mol/L尿素的缓冲液（20 mmol/L Tris-HCl、0.5 mol/L NaCl、不同浓度尿素，pH值8.0）中梯度透析复性，蛋白浓度控制在1 g/L。随后滴定稀释至10倍体积复性液（20 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl，pH值8.0）中，Nanodrop 2000测定蛋白浓度。1.7酶活力测定以Avicel、PASC和CS分别作为底物测定酶活力。总反应体系1 mL，包含50 mmol/L丁二酸缓冲液（pH值5.0）、10 mmol/L CaCl2、0.1%底物和适量纯化酶液，混合后分别于30~80 ℃反应5 h，12 000 r/min离心10 min，取100 µL上清液，加入终止液（对羟基苯甲酸酰肼∶0.5 mol/L NaOH=4∶1，混合），沸水浴10 min，冰浴冷却5 min，测定波长410 nm处的吸光度。测定在不同pH值丁二酸缓冲液（pH值4.0~8.0）下，70 ℃反应5 h对应的酶活。所有试验组均重复3次以上，标准差在图中以误差线标示。酶活力单位定义为每分钟催化产生1 µmol还原糖的酶量。将葡聚糖外切酶CelS和前期课题组制备的来源于海栖热袍菌的重组葡聚糖内切酶EG12B[15]分别水解0.1% CS，酶添加量均为10 μmol/L，70 ℃反应5 h（pH值6.0）。同时将两种酶等摩尔比混合复配为10 μmol/L用于水解0.1% CS，通过测定生成还原糖（葡萄糖）的含量计算酶活力。1.8三维结构分析在RCSB PDB（http://www.rcsb.org/）中下载已解析CelS的空间结构（PDB ID：1L2A、5YJ6）。通过PyMOL进行蛋白质空间结构的展示和比对分析[16]。采用LigPlot分析蛋白质与配体之间的相互作用[17]。2结果与分析2.1葡聚糖外切酶CelS的生物信息学分析及密码子优化根据UniProt公布的CelS蛋白质信息（登录号：P0C2S5），菌株来源于热纤梭菌，属于纤维素酶G48家族中外切葡聚糖纤维二糖酶（EC：3.2.1.176），能够从纤维素分子长链的还原性末端水解β-1, 4-葡萄糖苷键，主要产物为纤维二糖。CelS的一级序列共有741个氨基酸，经SignalP分析，N端1~27位氨基酸残基为信号肽区，切割位点位于第27和28位残基之间，切割后成熟肽为28~741区，共714个氨基酸残基，CelS的信号肽预测见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F001图1CelS的信号肽预测经ProtParam分析，CelS成熟肽的理论分子量为80 kDa，等电点为5.13，不稳定指数为30.23，由20种基本氨基酸组成，带负电荷残基（Asp+Glu）为88个，带正电荷残基（Arg+Lys）为67个。在体外，CelS的半衰期在哺乳动物细胞中为30 h，在酵母中大于20 h，在大肠杆菌中大于10 h。CelS的不稳定指数为30.23，脂肪指数为60.15，总亲水性平均系数GRAVY值为-0.572，表明CelS成熟肽为稳定的亲水性蛋白。为了实现CelS在大肠杆菌中的胞内高效表达，合成了成熟肽的核苷酸序列。分析显示，CelS成熟肽的原始基因序列的密码子适应指数（CAI）偏低，仅为0.74，这可能对其在大肠杆菌中的高效表达造成影响[18]。利用密码子偏好性进行优化后，使CAI值提高至0.96，以期提高CelS在大肠杆菌中的表达量。CelS成熟肽的密码子优化情况见图2。将优化后序列全基因合成后，插入质粒pET-22b的BamHⅠ~XhoⅠ中，构建获得重组质粒pET22-CelS。图2CelS成熟肽的密码子优化情况10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F2a1（a）优化前10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F2a2（b）优化后2.2重组CelS的诱导表达条件优化将重组质粒pET22b-CelS转化至表达宿主E. coli BL21（DE3）中，获得重组菌BL21（DE3）/pET22b-CelS。经0.1、0.25、0.5 mmol/L IPTG，分别在15、20、25 ℃诱导表达。SDS-PAGE结果表明，与未诱导对照相比，在不同诱导温度及IPTG浓度下，均在约75 kDa处有明显蛋白条带，这与理论分子量（80 kDa）有所偏差。推测可能是CelS为偏酸性蛋白、预染蛋白Marker的共价偶联染料在一定程度上影响了蛋白质的迁移速率，以及不同蛋白质结合SDS的能力不同等原因所致。凝胶定量分析CelS表达量约占全细胞蛋白的35%~40%，表明经信号肽删除和密码子优化，实现了重组CelS在大肠杆菌体系中的胞内高效表达。然而，CelS基本以包涵体形式表达，可溶表达比例极低。IPTG诱导条件优化见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F003图3IPTG诱导条件优化注：1为不诱导对照，2、5、8为全细胞蛋白，3、6、9为上清液，4、7、10为沉淀，M为预染蛋白Marker。为了提高可溶CelS的表达比例，利用自诱导培养基分别在15、20、25 ℃条件下培养60、48、24 h。SDS-PAGE结果表明，随着温度升高，CelS的总表达量逐渐增加，但可溶CelS的比例随之降低。在25 ℃自诱导条件下，CelS仍大多以包涵体形式表达，可溶CelS较少；在15 ℃自诱导条件下，虽然可溶CelS比例有所增加，但菌种生长缓慢，培养诱导时间过长，总蛋白表达量较低。综合分析，在20 ℃自诱导条件下，菌体生长和蛋白表达速度适中，有利于蛋白正确折叠，有效提高了可溶CelS的表达水平，比例提高至50%。自诱导条件的优化见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F004图4自诱导条件的优化注：1、4、7为全细胞蛋白，2、5、8为上清液，3、6、9为沉淀；M为预染蛋白Marker。2.3重组CelS的分离纯化胞内上清液经镍离子亲和层析分离纯化含6×His标签的可溶CelS，在高浓度咪唑（300 mmol/L）下CelS被竞争洗脱，再经热处理去除少量不耐热的杂蛋白。包涵体沉淀经TritonX-100洗涤，高浓度尿素变性，以及梯度透析和滴定复性后，获得包涵体复性CelS。SDS-PAGE检测显示，分离纯化后可溶和包涵体复性CelS均为单一条带，可用于下一步酶学性质测定与分析。重组CelS的分离纯化见图5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F005图5重组CelS的分离纯化注：1为可溶CelS亲和层析后，2为可溶CelS热处理后，3为包涵体复性CelS，M为预染蛋白Marker。2.4重组CelS的酶学性质分析重组CelS的酶活力测定结果见图6。由图6可知，在30~80 ℃条件下，分别测定可溶和包涵体复性CelS对底物PASC、Avicel和CS的酶活力。随着温度的升高，可溶CelS对3种底物的酶活力逐渐增强，超过70 ℃后开始降低，表明可溶CelS的最适反应温度为70 ℃。此时，对PASC的活性最高，酶活力达172.4 U/mg；对Avicel和CS的活性次之，分别为80.6和75.6U/mg。与可溶CelS相似，在70 ℃下包涵体复性CelS的酶活力最高，对PASC、Avicel和CS分别为169.3、81.8和78.4 U/mg，表明包涵体成功复性为具有活性的目的蛋白，且与可溶CelS相比，酶活力无显著性差别（P0.05）。图6重组CelS的酶活力测定结果10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F6a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F6a210.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F6a310.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F6a470 ℃时，可溶与包涵体复性CelS的酶活力变化趋势一致。随着pH值的升高，对3种底物的酶活力逐渐增强，在pH值5.0~6.5范围内，CelS的酶活力保持较高水平。当pH值超过6.0之后，酶活力逐渐降低。因此，CelS的最适反应pH值为5.5~6.0。2.5CelS的结构及功能分析CelS的三维结构见图7。由图7可知，CelS是典型糖苷水解酶第48家族成员，CelS与配体纤维二糖和纤维六糖复合体的整体结构（PDB ID：1L2A）为同型六聚体[19]，每个单体结构主要由典型（α/α）6桶（蓝色）、外围α螺旋和额外β折叠组成，1个纤维六糖和1个纤维二糖定位于结构域形成的通道中。其中，纤维六糖与氨基酸残基Trp326、Tyr431、Asn204、Lys301、Tyr302、Thr140、Gln247形成氢键，与Ala253、Tyr327、Phe206、Asn252、Thr251、Val430、Trp184、Gln207、Thr239、Asp241、Leu155、Trp340、Ala139、Trp338存在疏水相互作用。纤维二糖与His646、Trp645形成氢键，与Arg643、Asp520、Trp439、Glu76、His68、Glu87、Trp445、Phe442存在疏水相互作用。CelS与配体PEG的整体结构（PDB ID：5YJ6）为不对称单体，虽然与1L2A的整体结构类似，PEG分子（蓝色）与纤维寡聚糖分子（橙色）有相似的定位，但有一些氨基酸残基的构象发生了变化，推测CelS与底物之间存在诱导契合效应，以利于底物的结合和产物的释放，以及纤维素长链分子在底物结合通道中的移动。图7CelS的三维结构10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F7a110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.016.F7a22.6重组CelS与EG12B复配提高水解效率将重组CelS与海栖热袍菌葡聚糖内切酶EG12B单独水解CS，酶活力分别为84.6、173.1 U/mg。两种酶等摩尔比复配后，酶活力达234.2 U/mg，比单独水解酶活力提高了81.8%，表明复合纤维素酶通过协同作用有效提高了对CS的降解能力。其中，葡聚糖内切酶EG12B随机切割纤维素链的β-1, 4-糖苷键，将长链纤维素分子截短并暴露出糖苷键末端，随后葡聚糖外切酶CelS从局部断裂的纤维素分子链的还原端开始切割，产生纤维二糖和葡萄糖，这种协同作用增强了对CS的水解能力。3讨论纤维素酶作为一种安全、高效的绿色饲料添加剂，能够补充动物机体内源酶的不足，促进营养物质的消化与吸收，消除抗营养因子，提高饲料的利用率和动物的生长性能。此外，纤维素酶在改善生态环境和预防动物疾病方面也具有重要作用。因此，它在畜牧养殖生产中具有广阔的开发前景[20]。SO等[21]研究发现，利用纤维素酶发酵处理的甘蔗渣饲喂泰国本土牛，提高了牛的采食量、瘤胃发酵力、氮贮存量、能量投入量和代谢效率，使泰国本土牛表现出更好的肉用性能。张俊丽等[22]研究发现，采用纤维素酶处理糜草秸秆，显著提高了糜草发酵品质、营养价值和饲用价值。包晓佳[23]研究发现，使用纤维素酶处理玉米秸秆有效提高了黑山羊的生长性能及养分表观消化率。王国秀等[24]研究发现，添加纤维素酶和木聚糖酶处理大麦秸秆，有效提高了绵羊瘤胃降解速度。热纤梭菌能够分泌超分子酶系复合物——纤维小体，从而高效降解纤维素。葡聚糖外切酶CelS是纤维小体的关键成分。采用基因工程外源高效表达CelS是快捷有效的方法之一。大肠杆菌表达系统是目前应用较为广泛的外源蛋白表达系统[25]。然而，任何外源蛋白在大肠杆菌系统中的表达均具有挑战性[26]。可溶性重组蛋白的生产对工业和基础研究的发展至关重要。然而，多肽的错误折叠导致沉淀聚集仍是主要瓶颈[27]。研究发现，经IPTG诱导表达时，在不同诱导剂量和诱导温度下，CelS的总表达量虽然达35%以上，但均形成了大量无活性的包涵体，推测是由于在强启动子T7下，目的蛋白表达量过高，没有足够时间给予二硫键配对或者错误配对，同时胞内缺少蛋白质正确折叠的辅助因子[28]。此外，CelS中半胱氨酸和脯氨酸比例较高，可能与包涵体的形成有关。为了提高可溶蛋白表达的比例，尝试采用含有特定比例葡萄糖、甘油和乳糖的自诱导培养基进行诱导表达[29]。20 ℃自诱导培养有效提高了CelS可溶表达的比例。利用培养基中不同组分代谢物促进细胞生长，自动诱导lac启动子驱动蛋白表达，无需实时监测细胞密度和添加IPTG。该方案简化了诱导流程，减少IPTG对宿主的毒害作用，从而获得更高的细胞密度，提高了可溶蛋白的表达效率，为形成包涵体的重组蛋白表达提供了借鉴。包涵体复性是由热力学驱动的分子内折叠和分子间聚集的动力学竞争过程[30]。本研究首先经低浓度变性剂（2 mol/L尿素）和表面活性剂（2% TritonX-100）洗涤包涵体，去除细胞膜碎片和膜蛋白，再利用高浓度变性剂（8 mol/L尿素）溶解变性包涵体。通过温和梯度透析法，将变性蛋白溶液依次置于含6、4、2 mol/L尿素的缓冲液中，逐渐降低尿素浓度，以促进蛋白质正确折叠。随后置于稀释至10倍体积的无尿素的缓冲液中，避免了聚集体的形成，有利于蛋白质复性。此外，低浓度蛋白下复性有利于提高活性收率，蛋白浓度在透析过程中需控制在1 g/L以内。将胞内上清液通过镍离子亲和层析和热处理分离纯化获得可溶CelS，将胞内沉淀通过洗涤、变性和复性后获得包涵体复性CelS。两种表达形式的CelS酶活力无明显差异，最适反应温度均为70 ℃，最适反应pH值为5.5~6.0，对PASC的酶活力更高，对Avicel和CS的酶活力次之，这与前人报道的CelS底物特异性趋势一致[9-12]。空间构象表明，CelS的活性部位呈桶状，可使纤维素分子链顺利进入，从末端水解依次释放纤维二糖。纤维素完全水解需要葡聚糖内切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶共同参与，协同完成。课题组前期已成功克隆表达并分离纯化制备海栖热袍菌葡聚糖内切酶EG12B，具有突出的耐热性和良好的热稳定性[15]。该内切酶与热纤梭菌葡聚糖外切酶CelS复配制备复合纤维素酶，通过协同作用可有效提高对CS的水解效率。后续将着重开发耐热复合纤维素酶制剂，为提高饲料利用率提供优良复合饲料酶制剂。4结论本研究利用大肠杆菌表达系统实现了热纤梭菌葡聚糖外切酶CelS的高效表达。通过自诱导表达有效提高了可溶表达的比例。经分离纯化和变性复性后，可溶和包涵体复性CelS的酶活力无显著性差异，最适反应温度均为70 ℃，最适反应pH值为5.5~6.0，对无定形纤维素（PASC）的活性最高，结晶纤维素（Avicel）和玉米秸秆（CS）次之。与海栖热袍菌葡聚糖内切酶EG12B协同作用水解CS，比单独水解酶活提高了81.8%。研究表明，重组葡聚糖外切酶CelS具有优越的耐热性和纤维素水解活性，可以提高饲料的利用率。