黄花蒿（Artemisia annua）是双子叶植物纲、菊科、蒿属一年生草本菊科植物。黄花蒿及其提取物含有多种活性成分，包括青蒿素、挥发油、黄酮、多糖、香豆素等[1]。黄花蒿提取物具有提高畜禽生产性能，改善畜禽产品品质的作用[2]。另外，黄花蒿及其提取物还具有提高抗氧化功能和免疫力、杀菌、抗病毒等多重功效[3]。目前，提取黄花蒿活性成分的方法主要有煎煮法、回流提取法、有机溶剂提取法、超声波提取法、微波萃取法及CO2超临界萃取法等[4]。本试验采用的是回流提取法[5]。回流提取法的提取效果受多种因素影响，包括溶剂浓度、固液比、萃取温度、萃取时间等[6]。确定黄花蒿最佳提取工艺，不仅能提高活性物质的浓度，还能改善其饲喂效果。本试验以烟台地区的黄花蒿植株为材料，采用回流提取法提取青蒿素，并测定其抑菌活性，为黄花蒿青蒿素提取物在畜禽生产中的广泛应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用黄花蒿于2020年8月采自山东省烟台市市郊，按照中药材处理方法，阴干后切成1 cm小段，备用。1.2试验菌种金黄色葡萄球菌（保藏号：CICC 10384）、枯草芽孢杆菌（保藏号：CICC 10275）、大肠埃希菌（保藏号：CICC 23657）、黑曲霉（保藏号：CICC 2487）、酿酒酵母（保藏号：CICC 33032）均购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。1.3试验仪器RE52旋转蒸发仪（上海科兴仪器有限公司）、DZKW电热恒温水浴锅（苏州江东精密仪器有限公司）、SHZ-DⅢ循环水真空泵（上海耀特仪器设备有限公司）、蒸馏瓶（连云港东世石英科技有限公司）、冷凝管（盐城市隆发玻璃仪器有限公司）、DNP-9272A电热恒温培养箱（上海将任实验设备有限公司）、MHP-250霉菌培养箱（上海三发科学仪器有限公司）、LDZX-75KBS立式压力蒸汽灭菌器（上海申安医疗器械厂）、SW-CJ-1FD超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）。1.4试验设计1.4.1单因素试验采用单因素试验，以青蒿素得率为考查指标，研究乙醇浓度（35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%）、固液比（1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10）、萃取温度（40、50、60、70、80、90、100 ℃）、萃取时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h）对发酵效果的影响。1.4.2正交试验根据单因素试验结果确定正交试验参数，以青蒿素得率为考查因素，进行L9（34）的正交试验，确定黄花蒿提取的最佳工艺。1.5试验方法1.5.1确定最佳生产工艺分别取黄花蒿小段50 g装入1 000 mL蒸馏瓶中，提取溶剂为乙醇，采用回流提取法对每种提取方式重复3次，将3次回流提取液混合，再用旋转蒸发仪浓缩，并在水浴锅上蒸干，根据蒸干样重和黄花蒿荫干重计算青蒿素得率，每种提取方式重复3次，取平均值。参照杨申明等[7]方法。青蒿素得率=黄花蒿蒸干样重/黄花蒿荫干重×100%(1)1.5.2制备供试菌液用牛肉膏蛋白胨活化金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌，用马铃薯葡萄糖琼脂培养基活化黑曲霉和酿酒酵母[8]。收集对数生长期的菌/孢子于生理盐水中稀释成1×107 CFU/mL的供试菌液，备用。1.5.3测定抑菌圈直径采用滤纸片扩散法测定[9]。用打孔器将滤纸制作成直径为6 mm的滤纸片，灭菌、烘干后于黄花蒿提取物∶无水乙醚=1∶1的溶液中浸泡30 min，沥干。取100 μL供试菌液分别加在牛肉膏蛋白胨平板和马铃薯葡萄糖琼脂平板上，用涂布棒涂匀。用镊子夹取3张滤纸片贴于加有指示菌的平板上。另外放1片只浸有乙醚的滤纸片作为空白对照，每组试验重复3次。接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的平板置恒温培养箱中37 ℃培养24 h，接种酿酒酵母和黑曲霉的平板置恒温培养箱中28 ℃培养48~72 h，测定抑菌圈直径。1.5.4测定最低抑菌浓度最低抑菌浓度采用液体培养基倍比稀释法测定[10]。将灭菌后的培养基装入7支试管中，第1支试管装入1.2 mL培养基，其余6支装入1 mL培养基。在第1支试管中加入黄花蒿提取物0.8 mL，混匀后吸出1 mL加入第2支试管中，以此类推，第7支试管吸出1 mL废弃。同时设对照1：在1 mL培养基中加入30 μL黄花蒿提取物，对照2：在1 mL培养基中加入30 μL指示菌液。在含有不同体积分数黄花蒿提取物的试管和对照2试管中分别加入供试菌液30 μL，混匀。接种金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和大肠杆菌的试管36 ℃、180 r/min培养24 h，接种酿酒酵母和黑曲霉的试管28 ℃、150 r/min分别培养48 h和72 h。1.6数据统计与分析试验数据用Excel进行整理，并用SPSS 22.0统计分析软件进行多重比较和方差分析。2结果与分析2.1青蒿素的最佳生产工艺2.1.1单因素试验乙醇浓度分别为35%、45%、55%、65%、75%、85%、95%时对青蒿素得率的影响见图1。由图1可知，在乙醇浓度为65%时青蒿素得率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.F001图1乙醇浓度对青蒿素得率的影响固液比分别为1∶4、1∶5、1∶6、1∶7、1∶8、1∶9、1∶10时对青蒿素得率的影响见图2。由图2可知，在固液比为1∶8时青蒿素得率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.F002图2固液比对青蒿素得率的影响萃取温度分别为40、50、60、70、80、90、100 ℃时对青蒿素得率的影响见图3。由图3可知，在萃取温度为70 ℃时青蒿素得率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.F003图3萃取温度对青蒿素得率的影响萃取时间分别为1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h时对青蒿素得率的影响见图4。由图4可知，在萃取时间为3.5 h时青蒿素得率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.F004图4萃取时间对青蒿素得率的影响2.1.2正交试验根据单因素试验结果确定的正交试验方案见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.T001表1正交试验方案水平A乙醇浓度/%B固液比C萃取温度/℃D萃取时间/h1651∶6603.02751∶7703.53851∶8804.0青蒿素最佳生产工艺的正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.T002表2正交试验结果编号A乙醇浓度/%B固液比C萃取温度/℃D萃取时间/h得率/%1651∶6603.024.832651∶7703.526.233651∶8804.029.504751∶6803.528.475751∶7604.024.406751∶8703.026.537851∶6704.018.038851∶7803.019.679851∶8603.518.10K180.5671.3367.3371.03K279.3870.2971.8072.80K355.8074.1377.6371.93R8.251.283.440.5910.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.T003表3方差分析结果变异来源平方和自由度均方F值P值A乙醇浓度390.5702195.285349.8060.000B固液比7.86723.9347.0460.005C萃取温度54.934227.46749.2010.000D萃取时间1.56120.7801.3980.273误差10.049180.558由表2可知，不同提取工艺条件对得率的影响较大，各因素影响得率的主次顺序是：乙醇浓度萃取温度固液比萃取时间。从K值看，最优组合应该是A1B3C3D2,但是与第3组得率最高结果不一致。经验证，在乙醇浓度65%、固液比1∶8、提取温度80 ℃、提取时间4 h时提取，青蒿素得率最高。由表3可知，乙醇浓度、固液比、萃取温度对黄花蒿得率影响差异极显著（P0.01），萃取时间对得率影响差异不显著（P0.05），与极差值分析结果一致。2.2青蒿素的抑菌效果青蒿素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、酿酒酵母和黑曲霉的抑菌圈直径和MIC结果见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.024.T004表4青蒿素的抑菌圈直径和MIC结果项目金黄色葡萄球菌枯草芽孢杆菌大肠杆菌酿酒酵母黑曲霉抑菌圈直径/cm1.360.940. 960.751.40MIC/(mL/L)48.8192.4192.4192.448.8由表4可知，青蒿素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和黑曲霉均有一定抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌效果最好，最小抑菌浓度（MIC）为48.8 mL/L。3讨论3.1青蒿素的最佳生产工艺回流提取法是常见的提取植物活性成分的方法之一[11]。利用乙醇作为回流提取的有机溶剂，操作简便、提取率高、不污染环境[12]。用回流提取法提取植物中的活性成分时，溶剂浓度、固液比、萃取温度、萃取时间等是影响提取效率的重要因素。王丽芳等[13]研究表明，黄花蒿有效成分的最佳提取工艺条件是乙醇浓度55%、萃取温度95 ℃、萃取时间2 h、固液比为1∶8，且乙醇浓度、萃取温度为主要影响因素，萃取时间、固液比是次要影响因素。本试验选择乙醇作为提取溶剂，对提取黄花蒿活性成分的乙醇浓度、固液比、萃取温度、萃取时间进行优化。结果表明，回流提取法提取黄花蒿活性成分各因素主次顺序为乙醇浓度萃取温度固液比萃取时间，且最佳生产工艺参数为浓度为65%、固液比为1∶8、提取温度为80 ℃、提取时间为4 h，与前人研究结果相似。3.2青蒿素的抑菌效果葛水莲等[14]研究黄花蒿提取物对黑曲霉、青霉、绵霉的抑制效果，发现乙醇浓度为45%和50%时对青霉和黑曲霉的抑菌效果最好，最大抑菌圈直径可达15.6、14.5 mm，最大孢子萌发抑制率可达31.58%、27.08%。王书平等[15]研究发现，黄花蒿精油浓度为0.20%~0.40%时，可抑制大肠杆菌增殖，浓度为0.40%~0.80%时，可杀灭大肠杆菌；而黄花蒿精油浓度为0.40%~0.80%时，可抑制金黄色葡萄球菌增殖，浓度为0.80%~1.60%时，可杀灭金黄色葡萄球菌。刘亚丽等[16]研究表明，黄花蒿乙醇提取物还可以抑制单核增多性李氏杆菌、白色念珠菌、鸡源大肠杆菌、牛源金黄色葡萄球菌的增殖。本试验选择革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性细菌大肠杆菌，以及酿酒酵母和黑曲霉两种真菌作为考查对象，全面分析黄花蒿提取物的抑菌活性。试验结果表明，青蒿素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母和黑曲霉均有一定抑菌效果，且对金黄色葡萄球菌和黑曲霉的抑菌效果更好，抑菌圈直径分别为1.36、1.40 cm，MIC值达48.8 mL/L，与前人研究结果一致，说明黄花蒿提取物具有很好的抑菌活性。4结论本试验结果表明，回流提取法提取黄花蒿活性成分各因素主次顺序为乙醇浓度萃取温度固液比萃取时间；最佳生产工艺参数为浓度为65%、固液比为1∶8、提取温度为80 ℃、提取时间为4 h；青蒿素对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、酿酒酵母和黑曲霉均有一定抑菌活性，且对金黄色葡萄球菌和酿酒酵母的抑菌效果最好，MIC值为48.8 mL/L。