植物乳杆菌是厌氧或兼性厌氧的革兰氏阳性杆菌，是动物体内常见的益生菌，是我国农业农村部批准的绿色饲料添加剂之一，现已广泛应用于畜禽行业[1]。真空冷冻干燥技术常用于乳酸菌的制备过程，直接将菌体冷冻干燥很难得到存活率高、稳定性强的乳酸菌产品，但添加保护剂能有效提高乳酸菌的存活率高和贮存期[2]。研究在冷冻干燥过程中添加无免疫原性、无毒副作用、易于溶解、能维持细胞活性的保护剂，利用各保护剂间的相互作用保护菌体细胞免受损伤[3-5]，为植物乳杆菌生产及长期储存和植物乳杆菌在畜禽生产中的应用提供参考。1材料与方法1.1供试菌株植物乳杆菌由大连三仪动物药品有限公司生物工程研究所提供。1.2试剂及仪器海藻糖为食品级，由南宁中诺生物工程有限责任公司提供。脱脂奶粉由内蒙古伊利实业集团股份有限公司提供。硫代硫酸钠、磷酸氢二钾购自天津市科密欧化学试剂有限公司。淀粉为普通玉米淀粉，购自天津市科密欧化学试剂有限公司。GULS-10AUTO2000生物发酵智能控制系统（镇江东方生物工程设备技术公司）、DLSBI-097大容量低速离心机（三赛特湘仪离心机有限公司）、LGJ-12立式冷冻干燥机（北京松源华兴科技发展有限公司）、JJ500ZN电子天平[捷久计量衡器（上海）有限公司]、BC/BD-427HEF海尔冰柜（青岛海尔特种电冰柜有限公司）。1.3培养基1.3.1液体发酵培养基胰蛋白胨0.4%、酵母粉0.8%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、柠檬酸钠0.2%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸锰0.005%、牛肉膏1%、葡萄糖1%、乙酸钠0.5%、Tween-80 0.1%、硫酸镁0.02%，纯化水溶解，pH值为7.0。121 ℃高压灭菌30 min。1.3.2固体检测培养基胰蛋白胨0.4%、酵母粉0.8%、L-半胱氨酸盐酸盐0.05%、柠檬酸钠0.2%、磷酸氢二钾0.2%、硫酸锰0.005%、牛肉膏1%、葡萄糖1%、乙酸钠0.5%、Tween-80 0.1%、硫酸镁0.02%、琼脂粉17%，纯化水溶解，pH值为7.0。121 ℃高压灭菌30 min。1.4试验方法1.4.1菌泥样品制备将种子液按1%的接种量接种于10 L真核发酵罐中，37 ℃培养36 h，离心收集菌泥。1.4.2冻干粉制备按比例添加保护剂至菌泥中，-20 ℃冰柜预冻12 h，放入真空冷冻干燥机中真空冷冻干燥36 h，制备冻干粉。1.4.3测定冷冻干燥存活率将制备的冻干菌粉用0.9%的生理盐水倍比稀释，选适宜稀释梯度涂于MRS固体培养基中，37 ℃恒温培养18~24 h，计菌落数。根据残余活菌数计算存活率。存活率=冻干后样品测得的活菌数冻干前测得活菌数×100% (1)1.4.4单因素保护剂筛选试验设计根据文献[6-9]，选择淀粉为基础载体，按淀粉与菌泥1∶1的比例添加，其他8种保护剂为筛选的单因素保护剂，按表1的添加量添加。对添加单因素保护剂的试验样品，进行同批次真空冷冻干燥36 h，检测残余活菌数，计算存活率，筛选效果最佳的单因素保护剂种类。单因素保护剂筛选试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T001表1单因素保护剂筛选试验设计试验序号试剂名称添加量/%1淀粉100.02海藻糖15.03麦芽糊精15.04蔗糖15.05脱脂乳15.06乳糖15.07明胶15.08硫代硫酸钠0.29复合多维0.21.4.5植物乳杆菌保护剂筛选正交试验设计综合考虑单因素试验结果及不同保护剂在冷冻干燥过程中作用机理，选用海藻糖、脱脂乳、硫代硫酸钠、磷酸氢二钾4种物质作为正交试验保护剂种类。建立4因素3水平正交试验L9（34）作为保护剂的复合配方，植物乳杆菌保护剂筛选正交试验设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T002表2L9（34） 正交试验设计水平A海藻糖B脱脂乳C硫代硫酸钠D磷酸氢二钾15510.12101020.23151530.3%1.4.6植物乳杆菌加速储存试验设计将同批植物乳杆菌冻干样品置于不同温度下储存不同时间，计算不同温度不同时间下植物乳杆菌的残余菌数，根据温度及残余菌数变化建立Arrhenius方程[10-11]。加速储存稳定性试验设计见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T003表3加速储存稳定性试验设计温度/℃储存时间/d37361350369602461.4.7植物乳杆菌加速储存Arrhenius方程的建立试验中，同一储存温度下同批植物乳杆菌冻干样品活菌数应满足反应一级动力学方程:lnN0-lnN=kt(2)式中：N0为试验初始剩余活菌数（个/mL）；N为t时刻剩余活菌数（个/mL）；k为速率常数（h-1）；t为取样时间（h）。速率常数K（h-1）与绝对温度T（h）之间应满足Arrhenius方程：lnK=EaRT+常数 (3)式中：Ea为反应活化能（J/mol）；R表示理想气体常数[J/(mol.K)]；T表示绝对温度（K）。以lnK对1T作图，得到一条一元二次方程直线，通过该一元二次方程预测其他温度，4 ℃下的速率常数K，根据速率常数K推算4℃储存一定时间后的活菌数。1.4.8植物乳杆菌4 ℃储存稳定性试验设计4 ℃温度下、储存15、30、45 d，测定其残余活菌数，将检测结果和Arrhenius方程预测结果做对比，验证方程的正确性。2结果与分析2.1单因素保护剂筛选试验结果（见表4）由表4可知，1组淀粉组为对照组，8组试验组与对照组均有极显著差异（P＜0.01），从冻干得率数值上看8种不同类型单因素保护剂对植乳乳杆菌影响为：脱脂乳＞海藻糖＞明胶＞蔗糖＞硫代硫酸钠＞麦芽糊精＞复合多维＞乳糖。其中，脱脂乳、海藻糖、明胶、蔗糖的干燥得率极显著高于对照组（P＜0.01），而硫代硫酸钠、麦芽糊精、复合多维、乳糖的干燥得率极显著低于对照组（P＜0.01）。因此，脱脂乳、海藻糖、明胶、蔗糖均可以作为复配保护剂试验，并且4种物质中以海藻糖和脱脂奶粉的保护效果较为突出，保护率在50%以上，保护率是对照组的1.5倍左右。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T004表4单因素保护剂筛选试验结果试验序号试剂名称添加量/%干燥得率/%1淀粉10036.11±0.792海藻糖15.053.64±0.29**3麦芽糊精15.012.74±0.22**4蔗糖15.039.08±0.47**5脱脂乳15.056.35±0.11**6乳糖15.01.96±0.04**7明胶15.040.44±0.14**8硫代硫酸钠0.230.97±0.01**9复合多维0.28.25±0.16**注：与空白对照组比较，**表示差异极显著（P＜0.01）。2.2植物乳杆菌保护剂筛选正交试验结果（见表5、表6）由表5可知，海藻糖、脱脂乳、硫代硫酸钠、磷酸氢二钾影响存活率的因素依次为A＞B＞C＞D，A3B2C1D3为最优组合。根据最优组合，进行保护剂剂量筛选的验证试验，其存活率最高可达91%，并由极差可以看出，海藻糖对于冻干因素的影响大于其他3种因素，但其他3种物质在此次冻干保护中也有较好的表现。通过试验结果确定适于植物乳杆菌冷冻干燥的保护剂配方为：海藻糖15%、脱脂乳10%、硫代硫酸钠1%、磷酸氢二钾0.3%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T005表5正交试验结果试验号ABCD存活率/%111113721222613133343421236052231586231276731324683213919332182K147.00047.66768.00059.000K264.66770.00067.66761.000K373.00067.00049.00064.667R26.00022.33319.0005.667由表6可知，试验指标是产品的存活情况，F值越大说明对产品的影响越大，保护效果越好。四种保护剂对产品的影响为A＞B＞C＞D，海藻糖＞脱脂乳＞硫代硫酸钠＞磷酸氢二钾，与2.2正交分析表中K值结果相符。从显著性上看，A、B、C因素对产品有极显著性的影响（P＜0.01），D因素对产品有显著性影响（P＜0.05）。说明4种物质对产品存活率都有很好的保护作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T006表6正交试验方差分析参数Ⅲ型平方和自由度均方F值P值校正模型5 450.1118681.26463.9480.000截距68 696.889168 696.8896 448.3940.000A2 157.44421 078.722101.2570.000B1 697.4442848.72279.6670.000C1 469.4442734.72268.9660.000D125.778262.8895.9030.023误差95.880910.653总计74 242.88018矫正的总计5 545.99117注：R2=0.983 0 (调整R2=0.9670)2.3植物乳杆菌加速储存试验结果在验证产品稳定性时，留样观察是检验产品是否稳定的常见方法，此方法在现实操作过程中较费时间，因此采用样品加速储存试验来计算样品的存活率，便于在短时间内获得储存数据[12-14]。根据样品在37、50、60 ℃贮存时间不同，计算样品的残余活菌数，根据残余活菌数对数值（lgN）及贮存时间的倒数作图（见图1），求出37、50、60 ℃直线方程斜率k和R2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.F001图1植物乳杆菌剩余活菌数与储存温度和时间的关系由图1可知，冷冻干燥植物乳杆菌制品在37、50、60 ℃的热降解速率（K）的对数值（lgK）作为纵坐标，温度（绝对温度）的倒数（1/T）作为横坐标制图（见图2）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.F002图2植物乳杆菌热降解速率K与温度T的关系得到一元二次回归方程：lgK=-8 650/T+25.522，根据该方程可计算出4 ℃热降解速率常数，K=-2.04×10-6。李卫娟等[15]研究粪肠球菌的加速储存稳定性试验，方程推导出的4 ℃热降解速率，K=-1.15×10-6，与本研究4 ℃的热降解速率常数大致相符，说明本研究中菌株也具有较好热稳定性。2.4植物乳杆菌加速储存及验证试验结果（见表7）植物乳杆菌样品贮存于4 ℃温度下，分别在15、30、45 d检测其残余活菌数，与一元二次方程推算值进行比较，来验证方程的正确性。由表7可知，4 ℃下，由一元二次方程推算的存活率与实际检出存活率几乎一致。产品储存第15 d时，数据结果最为接近，只有1.4%的差别。说明本试验采用的数据推算数值符合实际操作，具有一定的指导意义。因此利用该方程预测4 ℃温度下，储存一定时间后样品的存活率具有很好的准确性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.023.T007表74 ℃下加速储存及验证试验结果储存时间/d推算存活率%实际存活率%1599.4098.003099.3996.404599.3295.603讨论在乳酸菌产品的制备中，冷冻干燥和产品储存是保证产品品质的两大重要环节。单纯的菌株在冷冻干燥过程中很难存活[16]。本研究得到保护剂的配方为：海藻糖15%、脱脂乳10%、硫代硫酸钠1%、磷酸氢二钾0.3%，利用此保护剂的作用相互促进作用使得植物乳杆菌的冻干存活率为90%以上。本研究中的存活率优于陈胜杰等[17]、牛春华等[18]植物乳杆菌冷冻干燥细胞存活率。在4 ℃储存45 d维持细胞活性95%以上。说明此保护剂配方的研发对植物乳杆菌的冻干及储存有很好的保护作用。乳酸菌的储存也受多种因素的影响，如：储存空间、储存环境、产品自身特性等，使得乳酸菌的储存成为广大科研工作者需攻克的技术难题。研究利用加速储存试验来推断4 ℃样品储存45 d时样品的残余活菌数，并将理论结果进行验证，发现实际检测值与理论推算结果相符，与张英华等[19]研究中乳酸菌储存稳定性的试验结论一致。结果说明此方程具有一定的实际应用意义，可以应用此方程推算其他温度下产品的稳定性。验证产品稳定性时，利用Arrhenius方程推算4 ℃产品的存活率。虽然对此方程进行了验证，但是Arrhenius方程是温度与反应速率关系的公式，是理想状态下推导获得的。实际保藏过程中影响产品存活率的因素极其复杂，很难用事实进行解释。菌株本身都有一定的灭亡规律，并非都能用理论中的热动力学公式进行评估预测。乳酸菌产品在冷冻及低温环境下本身就具有很高的存活率，因此产品在4 ℃有较好的稳定性。若使植物乳杆菌在其他温度或常温下也有良好的稳定性，从而实现产品长期储存，不仅需要在冷冻干燥保护剂方面进行调整，还需对菌株本身进行驯化，提高菌株的耐受能力，更需对发酵培养基及发酵参数进行优化，通过提高菌株耐受能力和发酵活菌数等方面实现菌株在长期储存过程中的稳定性。4结论根据单因素保护剂筛选及正交试验结果，确定保护剂的配方为海藻糖15%、脱脂乳10%、硫代硫酸钠1%、磷酸氢二钾0.3%，植物乳杆菌冷冻干燥得率在90%以上。产品在4 ℃储存45 d活菌数基本不变，活菌得率在95%以上。同批冻干样品储存稳定性方程为：LgK=-8650/T+25.522，并由此计算出4 ℃热降解速率常数为-2.04×10-6，通过4 ℃的验证试验，方程具有良好的正确定性。