紫苏（Perilla frutescens）是唇形科紫苏属一年生草本植物[1]，又名桂荏、白苏，其叶、茎、籽等均可为药[2]。紫苏叶中富含黄酮、多糖、咖啡酸以及花青素等多种功能活性成分[3-4]，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等药理功效[5-6]。因此，紫苏叶在生物医药和饲料工业等领域具有较大的应用潜力。我国已禁止在饲料中添加促生长类药物抗生素[7]，因此，养殖业亟需寻找一种优质、无公害的饲料添加剂作为抗生素替代品。目前，从紫苏叶中已经成功分离并鉴定出50多种黄酮类化合物[8-9]，这些化合物具有多种生物活性，可以在生物医药和饲料工业等领域应用[10-11]。研究发现，在基础饲粮中添加紫苏提取物可以提高鸡、鸭、鹅等家禽的肉品质及蛋品质[12]。因此，紫苏提取物作为一种安全的饲料添加剂具有广阔的应用前景。植物中黄酮类化合物的提取方法主要包括超声波辅助提取法[13]、酶解法[14]、微波提取法等[15]。其中，超声波辅助提取法利用超声波产生的空化效应，增加了溶剂的穿透力，促使目标提取物更易溶入提取溶剂中，从而提高提取效率[16]。超声波辅助提取法具有省时、节能、提取率高等优点，已被广泛应用于多种天然产物的提取中[17]。本试验采用超声波辅助法提取紫苏叶中的总黄酮，在单因素试验的基础上，利用响应面法优化其提取工艺参数，并分析紫苏叶总黄酮提取液的抗运动疲劳活性，以期为紫苏叶总黄酮的工业化生产和在饲料添加剂中的应用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂紫苏叶（河南农业大学农学院）、SPF级雄性小鼠（100只，体重18~20 g）（上海鸿运股份有限公司）、乳酸（BLA）检测试剂盒（上海雅吉生物科技有限公司）、无水乙醇（济南铭信化工有限公司）、醋酸钾（江苏安田化学有限公司）、尿素氮（BUN）检测试剂盒（上海恒远生物科技有限公司）、芦丁标准溶液（信阳莱耀生物科技有限公司）。1.2仪器设备UV-5120分光光度计（湖北聚创环保集团有限公司）、IDH-200超声波提取仪（北京爱安姆科学仪器有限公司）、FA2104电子分析天平（江苏鸿运集团有限公司）、OE-70电热鼓风干燥箱（天津中科瑞捷科技有限公司）、FW100高速粉碎机（上海书培实验设备有限公司）、LG20-W高速冷冻台式离心机（北京京立离心机有限公司）、Master Touch超纯水仪（上海和泰仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1样品预处理将采摘的紫苏叶40 ℃烘干至恒重，将紫苏叶研磨成粉末，过80目筛，放入洁净的玻璃容器中储存。1.3.2工作液的配制称取已烘至恒重的标准品10 mg（精确至0.001 mg）于50 mL棕色容量瓶中，加入适量无水乙醇，置于超声辅助提取仪中充分溶解，溶解完全后用无水乙醇定容至刻度，得到浓度为200 mg/L芦丁标准储备液。取7支25 mL棕色容量瓶，分别吸取200 mg/L芦丁标准储备液0、1、2、3、4、5、6 mL于容量瓶中，依次加入5% NaNO2溶液2 mL，摇匀后静置15 min，加入10% Al(NO)3溶液1 mL，摇匀后静置10 min，依次加入4% NaOH溶液10 mL，用60%乙醇定容至刻度后静置15 min，得到0、8、16、24、32、40、48 mg/L的系列标准曲线工作溶液。以0 mg/L的空白试剂为参比溶液，510 nm处用紫外可见分光光度计测定其吸光度。1.3.3紫苏叶总黄酮的提取及含量的测定称取紫苏叶粉末1.0 g（精确至0.01 g）于100 mL具塞试管中，以液料比15 mL/g加入85%的乙醇溶液，在超声辅助提取仪中提取，提取温度70 ℃、提取时间35 min。以7 500 r/min离心15 min，将移上清液置于200 mL容量瓶中，残渣重复提取2次，合并提取液，用60%乙醇溶液定容至刻度，得到紫苏叶总黄酮待测液。准确吸取3 mL待测液于25 mL棕色容量瓶，按照“1.3.2”步骤进行显色反应后，510 nm处测定其吸光度。根据芦丁标准曲线计算样品中总黄酮的质量分数[18]。X=c×V×Dm×1 000×100% (1)式中：X为样品中总黄酮含量（%）；c为样品提取液中总黄酮的数值（g/L）；V为体积（mL）；D为稀释倍数；m为样品质量（g）。1.3.4单因素试验设计分别考察4个单因素对紫苏叶中总黄酮提取率的影响，单因素试验设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.T001表1单因素试验设计考察因素固定因素水平考察因素水平乙醇体积分数液料比15 mL/g、提取温度70 ℃、提取功率160 W、提取时间35 min75%、80%、85%、90%、95%液料比乙醇的体积分数85%、提取温度70 ℃、提取功率160 W、提取时间35 min5、10、15、20、25 mL/g提取温度乙醇的体积分数85%、液料比15 mL/g、提取功率160 W、提取时间35 min40、50、60、70、80 ℃提取功率乙醇的体积分数85%、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃、提取时间35 min100、130、160、190、220 W提取时间乙醇的体积分数85%、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃、提取功率160 W20、25、30、35、401.3.5响应面试验设计为优化紫苏叶中总黄酮提取的最优工艺参数，根据单因素试验结果将其4个因素设置为自变量，以紫苏叶中总黄酮提取率为因变量（Y），采用Box-Behnken试验设计法进行响应面试验，响应面因素水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.T002表2响应面试验因素水平设计水平乙醇体积分数（A）/%液料比（B）/(mL/g)提取温度（C）/℃提取时间（D）/min-1801060300851570351902080401.3.6紫苏叶总黄酮抗运动疲劳活性试验SPF级雄性小鼠，饲养室温度为20~26 ℃，相对湿度为45%~50%。经适应性饲喂7 d后，按体质量随机将SPF级雄性小鼠分为4组，每组20只小鼠。空白对照组小鼠灌胃30 mL/kg BW生理盐水，试验组每日分别灌胃20、40、60 mL/kg BW紫苏叶总黄酮提取液。所选小鼠平均每日灌胃1次，连续灌喂30 d后，进行小鼠负重游泳试验及体内生化指标的测定，灌胃期间小鼠可自由进食和饮水。（1）小鼠负重游泳试验。末次灌胃小鼠30 min后，尾部绑上小鼠体重5%的铁丝，放入27 ℃游泳箱内，控制游泳箱内水深为30 cm，记录小鼠从进入水中起至头部完全没入水中保持10 s的时间，为小鼠负重游泳时间[19]。（2）小鼠血清生化指标的测定。将小鼠从游泳箱取出，吹干毛发后休息10 min，在眼底采血，分离血清，按照试剂盒法测定乳酸（BLA）与尿素氮（BUN）浓度等生化指标。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1乙醇体积分数对紫苏叶总黄酮提取率的影响（见图1）由图1可知，随着乙醇体积分数的增加，在75%~85%范围内，紫苏叶总黄酮提取率呈现上升趋势。当乙醇体积分数达到85%时，紫苏叶总黄酮提取率达到最大值，为4.54%，继续增加乙醇体积分数，总黄酮提取率反而有所降低。原因是乙醇体积分数较低时，紫苏叶总黄酮未能完全溶出，随着乙醇体积分数的增加，样品中总黄酮溶出更加完全[20]。但当乙醇体积分数超过85%时，其极性降低导致样品中脂溶性和醇溶性物质溶出，故总黄酮提取率会有所降低。因此，乙醇体积分数过高或过低均不利于紫苏叶总黄酮的提取。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F001图1乙醇体积分数对紫苏叶总黄酮提取率的影响2.1.2液料比对紫苏叶总黄酮提取率的影响（见图2）由图2可知，当液料比为5~15 mL/g时，随着液料比增加，紫苏叶总黄酮提取率呈现急剧增加的趋势。当液料比为15~25 mL/g时，总黄酮提取率反而有所降低。原因可能是随着提取溶剂用量的逐渐增加，样品中总黄酮类物质能够更加顺利地溶出，故在提取溶剂用量一定范围内，总黄酮提取率呈现急剧增加的趋势[21]，但过量的提取剂反而可能会溶出大量杂质，阻止了样品中总黄酮的溶出，因而导致样品中总黄酮提取率有所降低。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F002图2液料比对紫苏叶总黄酮提取率的影响2.1.3提取温度对紫苏叶总黄酮提取率的影响（见图3）由图3可知，当提取温度为40~70 ℃时，随着提取温度的上升，总黄酮提取率逐渐增大。原因是提取温度的升高，有助于增强乙醇对总黄酮的溶解能力。提取温度70 ℃是紫苏叶总黄酮的最优提取温度，此时总黄酮提取率为4.12%；继续升高提取温度，紫苏叶总黄酮提取率反而有所降低，原因可能是温度过高导致黄酮结构被破坏，从而导致紫苏叶总黄酮提取率有所降低[22]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F003图3提取温度对紫苏叶总黄酮提取率的影响2.1.4提取功率对紫苏叶总黄酮提取率的影响（见图4）由图4可知，当提取功率为100~160 W时，随着提取功率的逐渐增加，总黄酮提取率呈现增大的趋势；当提取功率为160~220 W时，总黄酮提取率随着功率的增加反而呈现降低的趋势。原因可能是微波功率的逐步增大，导致了提取溶剂温度上升，有助于加速黄酮类化合物从样品中溶出，故提取率逐渐增加；当提取功率达到160 W时，继续增加提取功率，紫苏叶总黄酮提取率反而有所降低。原因在于提取功率过大，导致提取溶剂温度升高，破坏了黄酮结构，从而导致提取率降低[23]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F004图4提取功率对紫苏叶总黄酮提取率的影响2.1.5提取时间对紫苏叶总黄酮提取率的影响（见图5）由图5可知，当提取时间在20~35 min时，随着浸提时间的延长，样品中总黄酮提取率逐渐增大。当提取时间为35 min时，总黄酮提取率达到最大值4.38%；继续延长提取时间，总黄酮提取率反而有所降低。原因是在一定时间范围内延长提取时间，总黄酮物质不断增加；但当提取时间达到最优条件35 min后，继续浸提会使黄酮受热引起其结构的破坏，从而导致其提取率下降。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F005图5提取时间对紫苏叶总黄酮提取率的影响2.2响应面试验结果及方差分析结果（见表3、表4）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.T003表3响应面试验结果试验号ABCD总黄酮提取率/%100004.35200004.453-100-12.594-10013.52500-113.18600004.34700004.64800112.329010-13.061010102.4511100-13.98120-1-102.3513-11002.1814-10-102.061510-103.251601102.981700004.0918-10102.741910012.762001-102.9121001-13.652201012.652300-1-12.24241-1003.12250-10-12.35260-1103.2727-1-1003.08280-1013.242911002.77利用Design-Expert10.0 软件建立数字回归模型，二次多元回归方程为：Y=4.37+0.18A-0.017B+0.12C-0.017D+0.14AB-0.37AC-0.54AD-0.21BC-0.32BD-0.57CD-0.74A2-0.80B2-0.87C2-0.61D2。由表4可知，模型极显著，失拟项P＞0.05，表明该方法对紫苏叶总黄酮提取率的预测可靠。模型的决定系数R2=0.987 5，校准系数为R2Adj=0.956 8，表明试验数据与模型拟合度较好[24]。影响紫苏叶总黄酮提取率的主次因素为：A＞C＞B＞D。AC、BD对黄酮提取率的影响显著（P0.05）；A2、B2、C2、D2及交互项AD、CD对黄酮提取率的影响极显著（P0.01)。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.T004表4方差分析结果项目平方和自由度均方F值P值合计15.28028模型14.060141.00011.4700.000 1A0.39010.3904.4400.053 6B0.06210.0620.7000.415 5C0.17010.1701.9200.187 5D3.330×10-313.330×10-30.0380.848 1AB0.07610.0760.8600.368 4AC0.55010.5506.2600.025 4AD1.16011.16013.2000.002 7BC0.18010.1802.0600.172 8BD0.42010.4204.8300.045 3CD1.29011.29014.7200.001 8A23.52013.52040.260＜0.000 1B24.20014.20047.970＜0.000 1C24.96014.96056.680＜0.000 1D22.39012.39027.3100.000 1残差1.230140.088失拟项1.070100.1102.6800.176 9纯误差0.16040.040注：P0.05表示影响显著，P0.01表示影响极显著。2.3各因素交互作用对总黄酮提取率的影响（见图6）响应曲面越陡峭、等高线呈椭圆形均说明两因素交互作用较强[25]。由图6可知，乙醇体积分数与提取温度、乙醇体积分数与提取时间、液料比与提取时间、提取温度与提取时间等交互作用对紫苏叶总黄酮提取率的影响较为显著；其中乙醇体积分数与液料比、液料比与提取温度的交互作用对紫苏叶总黄酮提取率的影响不显著，与二次回归方程的方差分析结果一致。图6各因素交互作用对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F6a1（a）乙醇体积分数与液料比对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F6a2（b）乙醇体积分数与提取温度对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F6a3（c）乙醇体积分数与提取时间对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F6a4（d）提取温度与液料比对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F6a5（e）提取时间与液料比对总黄酮提取率的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.F6a6（f）提取温度与提取时间对总黄酮提取率的影响2.4最优工艺条件的验证在提取功率设定为160 W的情况下，使用Design-Expert10.0软件分析得到的最优工艺参数为：乙醇的体积分数84.6%、液料比15.2 mL/g、提取温度70.4 ℃、提取时间34.6 min，在此条件下预测紫苏叶总黄酮提取率为4.61%。为方便实际操作，将其修正为乙醇的体积分数85%、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃、提取时间35 min。在此条件下进行了3次平行试验，紫苏叶总黄酮的平均提取率为4.67%，基本与预测值一致。2.5紫苏叶总黄酮提取液抗运动疲劳活性试验结果2.5.1紫苏叶总黄酮提取液对小鼠力竭游泳时间的影响（见表5）小鼠负重强迫游泳耐力试验是评价功能性成分是否具有抗运动疲劳功效的重要标准之一，其中游泳持续时间的长短能够反映动物运动疲劳的程度[26-27]。由表5可知，随着灌胃剂量的增加，小鼠游泳持续时间呈递增趋势。与空白对照组相比，不同剂量组小鼠力竭游泳时间显著增强（P0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组游泳时间分别比空白对照组延长了52.29%、123.96%、130.54%。研究表明，紫苏叶总黄酮提取液具有显著的抗运动疲劳作用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.T005表5紫苏叶总黄酮提取液对小鼠力竭游泳时间的影响（n=10）组别空白对照组低剂量组中剂量组高剂量组力竭游泳时间11.56±1.32c17.72±2.76b25.89±3.16a26.65±4.65a注：同行数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。min2.5.2紫苏叶总黄酮提取液对力竭游泳小鼠血清中BLA和BUN的影响（见表6）BLA是机体运动过程中酸性代谢产物之一，运动后机体积累的乳酸越多，机体会越疲劳[28-29]。因此，BLA水平常用来评价机体的疲劳程度。由表6可知，与空白对照组相比，各剂量组的BLA含量显著降低（P0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组的BLA分别为12.66%、28.28%、30.11%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.013.T006表6紫苏叶总黄酮提取液对力竭游泳小鼠血清BLA、BUN的影响组别BLABUN空白对照组12.09±1.56c11.08±1.05c低剂量组10.56±0.98b9.78±0.87b中剂量组8.67±0.91a7.78±0.54a高剂量组8.45±0.89a7.59±0.76a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母表示差异不显著（P0.05）。mmol/L机体在连续长时间、高强度运动过程中，由于部分蛋白质会参与代谢作用，进而产生血清BUN，BUN含量越高，机体高负荷的耐力越差，疲劳感也会有所增加[30-31]。由表6可知，与空白对照组比较，各剂量组的BUN含量均显著降低（P0.05），低剂量组、中剂量组、高剂量组的BUN含量分别比空白对照组降低了11.73%、29.78%、31.50%。3结论乙醇提取紫苏叶中总黄酮的试验最优的工艺参数分别为乙醇体积分数85%、液料比15 mL/g、提取温度70 ℃、提取时间35 min。验证试验表明，紫苏叶总黄酮提取率的平均值为4.67%，与模型预测值4.61%高度一致，证明了模型的可靠性。由小鼠负重游泳试验可知，连续灌胃紫苏叶总黄酮提取液30 d的小鼠，负重力竭游泳时间相对于空白对照组小鼠有所提升。紫苏叶总黄酮能够延缓血清中BLA与血清BUN含量的增加，有助于缓解小鼠机体疲劳，提高运动能力，表明紫苏叶总黄酮提取液具有抗疲劳活性。