小球藻（Chlorella vulgaris）是小球藻属[1]，为单细胞藻类，富含小球藻多糖、蛋白质、脂肪等生物活性物质[2]。小球藻在食品、医疗、农业等领域已得到许多研究[3]。随着生产技术水平的不断提高，小球藻在饲料领域的研究也逐渐深入[4-5]。研究表明，小球藻替代豆粕可促进鲤鱼对饲料的利用率，改善鱼肉的风味及品质，提升鱼肉的质构特征和系水能力[6]。在饲料中添加小球藻可以提高鱼的生长性能，增强鱼的抗氧化能力[7]。饲粮中添加20%小球藻可提高肉鸡的胸肌系水力，降低蒸煮损失，改善肉品质[8]。小球藻可以通过光自养、兼养、异养等方式培养，其生长迅速、耐温性广、适应性强[9-10]。培养小球藻可以处理养殖废水，增加经济效益[11]。钱峰慧[12]利用50 L培养罐异养培养小球藻，但生产的小球藻蛋白质和叶绿素含量较低，无法满足实际需求。目前，小球藻的应用较广泛[13-14]，关于小球藻培养基组成[15]、培养条件[16]、生物量[17-18]以及蛋白质和油脂含量[19-20]一直是相关研究的重点。本研究结合完善的工业化兼养设备，对L-丙氨酸、乙酸钠、酵母水解液、氰钴胺等因素进行响应面试验，优化小球藻兼养培养基配比，并利用优化的条件进行模拟生产，为小球藻作为饲料原料的工业化生产提供参考。1材料与方法1.1试验材料小球藻藻种由珠海光藻生命科学有限公司藻种库提供。基础培养基（略做修改）[14]：NaNO3 0.5 g/L、K2HPO4·3H2O 0.044 g/L、EDTA 0.001 g/L、MgSO4·7H2O 0.075 g/L、CaCl2·2H2O 0.036 g/L、柠檬酸铁铵0.006 g/L、乙酸钠1.673 g/L、MnSO4·H2O 2.23 μg/L、ZnSO4·7H2O 0.22 μg/L、CuSO4·5H2O 0.08 μg/L、氰钴胺0.04 μg/L，调节pH值至7.1，试验试剂均为分析纯。酵母水解液[14]：由啤酒酿造过程中的废弃酵母在55 ℃液化，形成氨基酸和多肽溶液，酵母水解液干物质量为3%。1.2仪器设备PH-3C酸度计、T-UV759紫外分光光度计、722N可见分光光度计、FA2204B分析天平购自上海佑科仪器仪表有限公司，SB-2000水浴锅购自上海朗仪器有限公司，LG10-2.4A离心机购自北京京立离心机有限公司，EYELA真空干燥机购自东京理化器械株式会社，LDZX-40Ⅱ型高压灭菌锅购自上海申安医疗器械厂，CX23显微镜购自奥林巴斯（中国）有限公司，SW-CJ-1FD-Ⅱ洁净工作台购自珠海赛乐特科技有限公司，工业化培养设备购自山东泽禹机械设备有限公司。1.3试验方法1.3.1操作流程称量试剂→培养基灭菌→一级培养→工业化设备清洗→灭菌→二级培养→培养结束→真空冷冻干燥→小球藻藻粉。具体操作为：培养基121 ℃高压灭菌锅灭菌30 min，使用煮沸锅加热到100 ℃，保温30 min；（一级培养）无菌环境下接种藻种20%，全程光照5 000~8 000 lx，温度（25.0±0.5）℃，通入洁净空气进行培养，通气量10~50 L/h，培养3.5 d；（二级培养）小球藻培养周期3.5 d，使用温控系统控制温度（25.0±0.5）℃，全程光照10 000~12 000 lx，通气量0.5~0.8 m3/h，培养周期结束加大通气量，混匀小球藻，称重，5 000 r/min离心10 min，清洗，在-40 ℃、0.01 kPa条件下干燥24 h[21-22]。1.3.2单因素试验分别考察L-丙氨酸、酵母水解液、乙酸钠和氰钴胺4个因素对小球藻生物量的影响。小球藻培养基优化的单因素试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T001表1小球藻培养基单因素试验的因素水平项目固定因素水平因素水平L-丙氨酸酵母水解液2.5 mL/L、乙酸钠1.5 g/L、氰钴胺0.05 μg/L1、2、3、4、5 g/L酵母水解液L-丙氨酸4 g/L、乙酸钠1.5 g/L、氰钴胺0.05 μg/L1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL/L乙酸钠L-丙氨酸4 g/L、酵母水解液2.5 mL/L、氰钴胺0.05 μg/L0.9、1.2、1.5、1.8、2.1 g/L氰钴胺L-丙氨酸4 g/L、酵母水解液2.5 mL/L、乙酸钠1.5 g/L0.01、0.05、0.10、0.15、0.20 μg/L1.3.3响应面试验设计在单因素试验的基础上，以L-丙氨酸（A）、酵母水解液（B）、乙酸钠（C）和氰钴胺（D）4个因素为自变量，以小球藻生物量（Y）为响应值，采用Minitab 19进行响应面优化试验。响应面试验因素与水平设计见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T002表2响应面试验因素与水平设计水平A/(g/L)B/(mL/L)C/(g/L)D/(μg/L)-132.01.20.01042.51.50.05153.01.80.101.3.4小球藻生物量的测定细胞计数法：称取1 mL藻液，按照浓度稀释相应的倍数，使用血球计数板计数。分光光度法：使用可见分光光度计在680 nm波长下，测定小球藻细胞液的吸光值，细胞浓度过大时，稀释相应倍数进行测量。干重法：称取50 mL小球藻藻液，5 000 r/min离心10 min，纯水洗涤两次，放入干燥的培养皿中，称重，冻干24 h，称重。1.3.5小球藻理化指标的测定蛋白质含量根据《食品安全国家标准 食品中蛋白质的测定》（GB 5009.5—2016）进行测定，脂肪含量根据《食品安全国家标准 食品中脂肪的测定》（GB 5009.6—2016）进行测定，灰分含量根据《食品安全国家标准 食品中灰分的测定》（GB 5009.4—2016）进行测定，水分含量根据《食品安全国家标准 食品中水分的测定》（GB 5009.3—2016）进行测定；叶绿素含量测定采用乙醇提取比色法[12]，铅含量根据《食品安全国家标准 食品中铅的测定》（GB 5009.12—2017）进行测定，砷含量根据《食品安全国家标准 食品添加剂中砷的测定》（GB 5009.76—2014）进行测定，汞含量根据《食品安全国家标准 食品中总汞及有机汞的测定》（GB 5009.17—2021）进行测定，镉含量根据《食品安全国家标准 食品中镉的测定》（GB 5009.15—2014）进行测定。藻粉质量标准参考《新资源食品管理办法》进行评定。1.3.6小球藻微生物指标的测定菌落总数根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定》（GB 4789.2—2022）进行测定，大肠杆菌数量根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数》（GB 4789.3—2016）进行测定，霉菌和酵母数量根据《食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数》（GB 4789.15—2016）进行测定。1.4数据统计与分析使用SPSS 25软件对数据进行分析处理，Minitab 19软件进行响应面分析，Design-Expert 12进行响应面绘图。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1单因素试验结果2.1.1L-丙氨酸对小球藻生长的影响（见表3）L-丙氨酸、乙酸钠等是食品防腐剂的原料之一[23]。由表3可知，当L-丙氨酸浓度为4 g/L时，小球藻的生物量达到最大，此时OD680 nm值达到4.573。当L-丙氨酸浓度较低时，小球藻生长呈上升波动的状态，没有达到最快生长速率；当L-丙氨酸浓度超过4 g/L时，营养元素过剩，成为小球藻生长的限制因素，且当L-丙氨酸浓度不断增大时，小球藻代谢产物不断增加影响通气效果，pH值无显著变化。因此，L-丙氨酸可以作为优质的小球藻生长氮源，并选择4 g/L的添加量进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T003表3L-丙氨酸对小球藻生长的影响L-丙氨酸/(g/L)干重/(g/L)细胞数/(×109个/L)OD680 nm值pH值12.450±0.043c59.901±1.055c3.600±0.064c8.80±0.06a22.755±0.018b67.523±0.438b4.126±0.026b8.67±0.15a32.693±0.336b66.017±0.817b4.034±0.049b8.78±0.03a43.065±0.016a73.841±0.411a4.573±0.025a8.77±0.03a52.727±0.031b66.617±0.771b4.071±0.047b8.78±0.09a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.1.2酵母水解液对小球藻生长的影响（见表4）酵母水解液是对废弃酵母的资源化利用，可有机结合微藻培养和啤酒生产[24]，富含氮源等多种微量元素[25-26]。由表4可知，随着酵母水解液的添加量增加，小球藻生物量呈现先上升后下降的趋势。当酵母水解液添加量为2.5 mL/L时，小球藻生物量达到最大值，此时OD680 nm值为4.599；继续增大酵母水解液的浓度时，生物量增长开始减缓。研究表明，过高浓度的营养物并不会加快小球藻的生长，反而会形成抑制作用影响小球藻的快速生长，小球藻的pH值当酵母水解液添加量到3.0 mL/L时出现显著变化，因此选择2.5 mL/L的添加量进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T004表4酵母水解液对小球藻生长的影响酵母水解液/(mL/L)干重/(g/L)细胞数/(×109个/L)OD680 nm值pH值1.02.632±0.031d64.63±0.71d3.944±0.047d8.69±0.03b1.52.743±0.033c68.04±0.85c4.094±0.050c8.74±0.06b2.02.833±0.041b69.42±1.19b4.242±0.062b8.70±0.05b2.53.063±0.022a74.20±0.58a4.599±0.032a8.82±0.03ab3.02.882±0.015b70.62±0.36b4.315±0.023b8.89±0.01a2.1.3乙酸钠对小球藻生长的影响（见表5）乙酸钠在藻类培养过程中应用广泛[27]。由表5可知，随着乙酸钠的添加量增加，小球藻生物量呈现先上升后下降的趋势，pH值也呈现下降趋势。乙酸钠是小球藻兼养培养的优质碳源，乙酸钠的添加促进了兼养培养的小球藻快速生长，减少了小球藻对于光合作用的依赖，生长速度更加快速。当乙酸钠添加量为1.5 g/L时，小球藻生物量达到最大值，此时OD680 nm值为4.538，继续增加乙酸钠的添加量，培养基pH值的平衡会受到影响，小球藻的生长受到抑制，因此选择1.5 g/L的添加量进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T005表5乙酸钠对小球藻生长的影响乙酸钠/(g/L)干重/(g/L)细胞数/(×109个/L)OD680 nm值pH值0.92.515±0.045d61.41±1.10d3.756±0.067d8.81±0.03a1.22.647±0.038c65.88±0.91c3.966±0.057c8.74±0.03a1.53.132±0.033a73.23±0.87a4.538±0.049a8.78±0.01a1.82.821±0.035b67.61±0.85b4.194±0.052b8.60±0.05b2.12.568±0.031cd63.91±0.77cd3.863±0.047cd8.51±0.06b2.1.4氰钴胺对小球藻生长的影响（见表6）氰钴胺又称维生素B12，在小球藻的生长繁殖过程中必不可少[28]。由表6可知，随着氰钴胺的添加量增加，小球藻生物量呈现先上升后波动的趋势，pH值变化不显著。当氰钴胺添加量为0.05 μg/L时，小球藻生物量达到最大值，此时吸光度为4.539，pH值无显著变化；Co元素在酶反应和生物合成中起到重要作用，随着氰钴胺添加量的增多，生物量的变化呈现波动变化的趋势，对生物量的影响作用减少，因此选择0.05 μg/L的添加量进行后续试验。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T006表6氰钴胺对小球藻生长的影响氰钴胺/(μg/L)干重/(g/L)细胞数/(×109个/L)OD680 nm值pH值0.012.826±0.066c69.25±1.62c4.232±0.099c8.80±0.030.053.033±0.036a74.37±0.88a4.539±0.054a8.75±0.050.102.931±0.020b71.81±0.50b4.388±0.030b8.79±0.030.152.802±0.059c68.72±1.44c4.200±0.088c8.81±0.050.202.881±0.02bc70.64±0.56bc4.314±0.031bc8.83±0.062.2小球藻培养基响应面优化试验结果与方差分析2.2.1响应面试验结果根据单因素试验结果，以L-丙氨酸（A）、酵母水解液（B）、乙酸钠（C）和氰钴胺（D）等4个因素为自变量，小球藻生物量OD680 nm值（Y）为响应值进行响应面试验，结果见表7。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T007表7小球藻培养基响应面试验结果试验号ABCDY1-10104.025200004.5683-10-104.053410104.1325-10014.172600004.454710-104.406801104.052900004.5161000004.567110-1-104.05512001-14.1841300-1-14.1141410014.3631500114.1721600-114.28917010-14.2351800004.54719-1-1004.0402011004.255210-10-14.1892201014.44123-11004.35624-100-14.201250-1014.189260-1104.12627100-14.1962801-104.285291-1004.273利用软件Minitab 19对数据进行回归拟合，以未编码单位得到回归方程为：Y=4.530 4+0.064 8A+0.062 7B-0.042 6C+0.042 2D-0.156 3A2-0.153 3B2-0.228 7C2-0.122 2D2-0.083 5AB-0.061 5AC+0.049 0AD-0.076 0BC+0.051 5BD-0.046 8CD。小球藻兼养培养基响应面优化方差结果见表8。由表8可知，模型极显著（P0.01）且失拟项不显著（P0.05），决定系数R2=0.947 3，变异系数1.27，拟合程度高模型可靠。由方差分析可知，A、B、A²、B²、C²、D²和AB具有极显著影响（P0.01），C、D、AC、BC具有显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T008表8响应面试验方差分析结果项目自由度平方和均方F值P值合计280.776 934模型140.736 0040.052 57217.980.000A10.050 4400.050 44017.250.001B10.047 1250.047 12516.120.001C10.021 7600.021 7607.440.016D10.021 4210.021 4217.330.017A210.158 5140.158 51454.220.000B210.152 4880.152 48852.160.000C210.339 2670.339 267116.050.000D210.096 8620.096 86233.130.000AB10.027 8890.027 8899.540.008AC10.015 1290.015 1295.170.039AD10.009 6040.009 6043.290.091BC10.023 1040.023 1047.900.014BD10.010 6090.010 6093.630.078CD10.008 7420.008 7422.990.106误差140.040 9300.002 924失拟100.031 8570.003 1861.400.398纯误差40.009 0730.002 268注：P0.01表示影响极显著，P0.05表示影响显著。利用Design-Expert 12软件进行响应面绘图，结果见图1。由图1可知，小球藻培养基响应曲面坡度越大，影响越显著，结合方差分析F值发现L-丙氨酸（A）对小球藻生物量（Y）影响最大，其次是酵母水解液（B），乙酸钠（C）和氰钴胺（D）对小球藻生物量（Y）的影响较小。4个因素之间的交互影响通过图1中的等高线曲线斜率进行评价，结合P值发现AD、BD、CD交互作用均不显著（P0.05），AC、BC交互作用显著（P0.05），AB交互作用极显著（P0.01）。图1各因素交互作用对小球藻兼养培养OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F1a1（a）L-丙氨酸和酵母水解液对小球藻兼养培养基OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F1a2（b）L-丙氨酸和乙酸钠对小球藻兼养培养基OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F1a3（c）L-丙氨酸和氰钴胺对小球藻兼养培养基OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F1a4（d）酵母水解液和乙酸钠对小球藻兼养培养基OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F1a5（e）酵母水解液和氰钴胺对小球藻兼养培养基OD680 nm值的影响10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F1a6（f）乙酸钠和氰钴胺2.2.2回归模型验证通过响应面试验得到小球藻兼养培养基最优配比工艺为L-丙氨酸4.23 g/L、酵母水解液2.62 mL/L、乙酸钠1.44 g/L、氰钴胺0.068 μg/L，预测得到小球藻生物量OD680 nm值为4.563。按照最优试验进行验证试验，得到小球藻生物量OD680 nm值为（4.651±0.033），细胞数达到76.11×109个/L，干重3.75 g/L，与预测结果相近，说明响应面试验得到的小球藻兼养培养基培养效果可靠。2.2.3工业化生产验证结果小球藻在300 L培养罐中的生长曲线见图2。由图2可知，相同生长周期内，优化培养基是基础培养基生物量的1.8倍，表明工业化验证兼养培养基的效果可靠，兼养培养基中营养丰富，小球藻代谢产物增多，但泡沫丰富会影响培养周期结束后的清除工作，因此需要更大生物量小球藻时，需要采用流加工艺，使小球藻保持在2~3 d时的生长速率，从而快速获得小球藻。通过300 L培养罐验证试验可知，L-丙氨酸、乙酸钠可以作为优质氮源、碳源在小球藻生长的基础原料中应用，同时废弃啤酒酵母的增加也将微藻生产与啤酒产业有机联合[24]，能够促进小球藻在饲料[29]、食品等领域应用。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.F002图2小球藻在300 L培养罐中的生长曲线2.3小球藻藻粉的品质分析2.3.1感官分析取10 g小球藻藻粉，在自然光线下观察色泽和状态，闻味并温开水漱口，品尝分析。结果发现，藻粉外观均匀粉末、细腻、无结块，色泽墨绿、均匀一致，具有特殊芳草的香味、无异味，无肉眼可见杂质。2.3.2不同培养基小球藻藻粉理化指标测定结果（见表9）由表9可知，优化培养基藻粉蛋白质含量57.33 g/100 g，水分含量4.40 g/100 g，灰分含量4.87 g/100 g，叶绿素含量40.47 mg/g，铅、砷含量低于0.1 mg/kg，汞、镉未检出。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.015.T009表9不同培养基小球藻藻粉理化指标测定结果项目蛋白质/(g/100 g)水分/(g/100 g)灰分/(g/100 g)叶绿素/(mg/g)铅/(mg/g)砷/(mg/g)汞/(mg/g)镉/(mg/g)基础培养基藻粉59.274.314.5445.780.10.1未检出未检出优化培养基藻粉57.334.404.8740.470.10.1未检出未检出2.3.3小球藻微生物指标测定结果经试验测定，菌落总数3 000 CFU/g，大肠菌群小于3.0 MPN/g，霉菌、酵母菌数量为10 CFU/g，大肠杆菌、致病菌未检出，以上指标均符合行业标准。3结论本试验通过单因素及响应面试验，确定小球藻兼养培养基最佳配比为L-丙氨酸4.23 g/L、酵母水解液2.62 mL/L、乙酸钠1.44 g/L和氰钴胺0.068 μg/L，小球藻OD680 nm值达到4.651，细胞数76.11×109个/L，干重3.75 g/L。在300 L工业化生产验证中，优化培养基生物量是基础培养基的1.8倍，优化藻粉品质优良，蛋白质57.33 g/100 g，水分4.40 g/100 g，灰分4.87 g/100 g，叶绿素40.47 mg/g，铅、砷含量低于0.1 mg/kg，汞、镉未检出，品质接近基础培养基所生产的小球藻藻粉，微生物指标均符合行业标准。