博落回[Macleaya cordata (Willd.) R.Br.]是罂粟科博落回属的多年生直立草本植物[1]，在我国湖南、湖北、广西和广东等地区广泛分布[2-3]。博落回生物碱主要有六大类，约30种，异喹啉类生物碱为博落回植物中主要生物活性物质[4]，主要有4种：血根碱（sanguinarine，SA）、白屈菜红碱（chelerythrine，CHE）、原阿片碱（protopine，PRO）和别隐品碱（allocryptopine，ALL）[5]。博落回中生物碱的提取方法包括渗透法、回流法、高速逆流色谱法[6]、内部沸腾法[7]和超声波辅助提取法[8]等。现代药理研究发现，博落回具有抑菌抗炎、抗肿瘤、杀虫等功效[9-10]，具有广谱抗菌性、无残留、安全性好等优点[11-12]。目前，博落回已被欧洲食品安全局认可为动物生产的饲料添加剂[1]，且可有效代替抗生素使用[13]。博落回注射液和博落回提取物的现行国家标准可见《兽药质量标准2017年版》和《兽药质量标准汇编：2006—2011年》中，博落回注射液是由罂粟科博落回的果实经提取分离制成的生物碱硫酸盐水溶液[14]。血根碱和白屈菜红碱是博落回注射液中的主要有效成分，也是博落回提取物中主要的生物碱。博落回注射液可有效治疗仔猪痢疾，但目前博落回注射液产品质量仍无法得到保证。因此，本试验用高效液相色谱法测定市售博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的含量，为制定博落回注射液质量评价标准及实际应用提供参考。1材料与方法1.1药品与试剂血根碱对照品（批号AF21020828）、白屈菜红碱对照品（批号AF20050908）由成都埃法生物科技有限公司提供，甲醇、乙腈均为色谱纯（斯百全化学有限公司），磷酸为分析纯（国药集团化学试剂有限公司），水为纯化水。博落回注射液5批，分别是芮城县同仁兽药有限公司（批号220301，厂家A）、吉林省华牧动物保健品有限公司（批号20201104，厂家B）、山东圣旺药业有限公司（批号20220801，厂家C）、合肥强力动物药品有限责任公司（批号20211001，厂家D）、芮城县维尔富兽药有限公司（批号20210101，厂家E）。1.2主要仪器安捷伦1200高效液相色谱仪（四元泵，自动进样器及紫外检测器）购自美国安捷伦科技有限公司，SB-5200D型超声波清洗机购自宁波新芝生物科技股份有限公司，XB 220A型电子天平（d=0.0l g）、XB 220A型电子天平（d=0.000 1g）购自广州广电计量检测股份有限公司。1.3试验方法1.3.1色谱条件色谱柱：Agilent（5 μm，4.6 mm×250.0 mm），柱温30 ℃，波长270 nm，流速1.0 mL/min，进样量为5 μL。流动相乙腈（A）和0.1%磷酸（B），洗脱条件：0~5 min，25% A，5~12 min，25%~60% A，12~15 min，60%~25% A，15~25 min，25% A。1.3.2对照品溶液的制备精密称取血根碱对照品1 mg、白屈菜红碱对照品12 mg，分别置于10 mL容量瓶中，加1%盐酸-甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，分别制成1 g/L的血根碱对照品溶液和1.2 g/L的白屈菜红碱对照品溶液。分别精密量取上述血根碱对照品溶液0.5 mL、白屈菜红碱对照品溶液1.0 mL于10 mL容量瓶中，稀释至刻度，配制成含有0.05 g/L血根碱和0.12 g/L白屈菜红碱的混合对照品溶液。1.3.3供试品溶液的制备取5个不同厂家的博落回注射液0.1 mL于10 mL容量瓶中，用1%盐酸-甲醇溶液定容。1.3.4方法学考察（1）专属性考察。吸取适量空白甲醇溶液、混合对照品溶液以及供试品溶液，按照1.3.1规定的色谱条件进行测定，获得相应的色谱图。（2）线性关系考察。取适量血根碱对照品溶液和白屈菜红碱对照品溶液，分别按1.3.1色谱条件进样1、2、5、10、20、50 mg/L的血根碱对照品溶液和1.2、2.4、6、12、24、60 mg/L的白屈菜红碱对照品溶液，以浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，建立标准曲线图。（3）精密度试验。精密度是在规定的测定条件下，同一浓度样品在一系列测量值的分散程度，用相对标准差（RSD）表示。取1.3.2中的对照品溶液，按照1.3.1色谱条件连续进样6次，计算相对标准偏差（RSD）。（4）重复性试验。按1.3.3方法制备供试品溶液6份（厂家A），按照1.3.1项下色谱条件，连续进样6次，计算相对标准偏差（RSD）。（5）稳定性试验。取1.3.3下供试品溶液（厂家A），按照1.3.1下色谱条件分别在1、2、4、8、12、24 h下进样，测定不同时间下的峰面积，考察其稳定性，计算RSD值。（6）回收率试验。精密量取博落回注射液6份（厂家A），每份0.1 mL，置于10 mL容量瓶中，分别加入1 g/L血根碱对照品溶液和0.06 g/L白屈菜红碱对照品溶液适量，按照1.3.1下色谱条件进样测定该加样回收样品溶液，计算加样回收率。（7）样品含量测定。取5个厂家的样品适量，每个厂家取样2份，按1.3.3项方法制备样品溶液，按照1.3.1项色谱条件进样，记录峰面积，计算各厂家注射液中血根碱和白屈菜红碱的浓度。2结果与分析2.1色谱柱的选择本试验比较了Agilent色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）和Thermo色谱柱（5 μm，4.6 mm×150 mm），结果发现，Thermo色谱柱无法检测到色谱峰；而Agilent色谱柱能够使测定的血根碱和白屈菜红碱达到基线分离，且重复性较好，与所用流动相兼容。因此，本研究选择Agilent色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）进行后续试验。2.2色谱条件的优化本文通过阅读文献[15-16]，考察了0.2%三乙胺-乙腈和0.1%磷酸水-乙腈分别作为流动相，进行梯度洗脱，在0.1%磷酸水-乙腈的色谱图中，基线平稳，目标峰响应较好，洗脱效果良好。因此，选择0.1%磷酸水-乙腈作为本试验的流动相。2.3检测波长的选择在检测波长的选择中，根据文献[17-18]，选择270 nm和286 nm作为检测波长，结果显示，在270 nm下同时测定血根碱和白屈菜红碱有较高吸收值，且分离度良好。因此，选择270 nm作为检测波长。2.4方法学考察结果2.4.1专属性考察结果（见图1）由图1可知，在所选用的色谱条件下，对博落回注射液的含量测定无干扰，血根碱保留时间约9.5 min，白屈菜红碱保留时间约11.0 min，色谱峰分离度良好，空白辅料不干扰目标物质的测定，该检测方法的专属性符合要求。图1专属性考察结果注：1为血根碱，2为白屈菜红碱。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.F1a1（a）空白甲醇溶液10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.F1a2（b）混合对照品溶液10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.F1a3（c）供试品溶液2.4.2血根碱、白屈菜红碱线性曲线（见图2、图3）由图2、图3可知，血根碱的回归方程为y=26.928x-4.093 4，R2=0.999 3，白屈菜红碱的回归方程为y=28.764x+31.237，R2=0.998 5，线性关系良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.F002图2血根碱线性曲线10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.F003图3白屈菜红碱线性曲线2.4.3精密度试验结果（见表1）由表1可知，血根碱和白屈菜红碱的精密度RSD分别为0.45%、0.09%，表明该仪器精密度良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.T001表1精密度试验结果项目峰面积/(mAU·s)RSD/%123456血根碱171.0169.4170.9169.6171.1170.60.45白屈菜红碱319.9319.2319.1319.6319.4319.40.092.4.4重复性试验结果（见表2）由表2可知，供试品溶液（厂家A）血根碱重复性RSD为1.57%，白屈菜红碱重复性RSD为1.41%，表明本方法重复性良好。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.T002表2重复性试验结果项目峰面积/(mAU·s)RSD/%123456血根碱706.8717.3969.8720.9698.8721.71.57白屈菜红碱404.5410.8401.4413.1401.6414.01.412.4.5稳定性试验结果（见表3）由表3可知，供试品溶液（厂家A）血根碱稳定性RSD为0.60%，白屈菜红碱稳定性RSD为0.39%，说明本品在该条件下24 h内稳定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.T003表3稳定性试验结果项目峰面积/(mAU·s)RSD/%1241224血根碱776.3776.2778.6784.7785.90.60白屈菜红碱443.1445.2446.7447.3444.30.392.4.6血根碱、白屈菜红碱回收率试验结果（见表4、表5）由表4可知，血根碱的平均回收率为100.68%，RSD值为0.75%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.T004表4血根碱回收率试验结果序号原有量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.289 60.290.580 1100.17100.680.7520.289 60.290.580 7100.3830.289 60.290.584 8101.7940.289 60.290.581 1100.5250.289 60.290.579 799.8360.289 60.290.583 7101.41由表5可知，白屈菜红碱的平均回收率为104.60%，RSD值为0.80%，表明该方法准确度良好，不干扰博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱的含量测定。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.T005表5白屈菜红碱回收率试验结果序号原有量/mg加入量/mg测得量/mg回收率/%平均回收率/%RSD/%10.143 60.144 00.292 9103.68104.600.8020.143 60.144 00.292 6103.4730.143 60.144 00.294 5104.7940.143 60.144 00.294 9105.0750.143 60.144 00.294 8105.0060.143 60.144 00.295 6105.562.4.7样品含量测定试验结果（见表6）由表6可知，各厂家之间样品有效成分含量不一。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2024.05.020.T006表6样品含量测定试验结果编号批次有效成分供试品浓度/(mg/L)注射液浓度/(g/L)A220301血根碱28.962.900白屈菜红碱14.361.440B20201104血根碱28.552.860白屈菜红碱14.391.440C20220801血根碱7.070.710白屈菜红碱18.711.870D20211001血根碱26.432.640白屈菜红碱13.671.367E20210101血根碱21.842.180白屈菜红碱13.891.3903讨论白屈菜红碱和血根碱是博落回注射液的主要成分，近年来关于博落回生物碱及其生物活性的研究不断涌现。血根碱和白屈菜红碱的抑菌效果显著[19]，对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌和某些真菌均有不同程度的抑制作用[20]，显示出广谱抑菌性。在发挥抑菌作用的同时还能够缓解病原菌感染引起的各种炎症反应，使炎症因子基因的表达下降，IL-10基因的表达增高，通过NF-κB介导的信号通路发挥抗炎作用[21-22]。此外，血根碱还可通过对动物体内的过氧化酶活性及活性氧通路的抑制[23]，增强机体的抗氧化能力和免疫能力，在畜禽养殖方面具有一定的应用前景。本试验结果表明，5个厂家的血根碱和白屈菜红碱的成分差异较大，其中A、B厂家产品的血根碱含量明显高于其他厂家，C厂家血根碱的含量对比其他厂家较少，但其白屈菜红碱在5个厂家中含量最高。这可能是由于《兽药质量标准》中缺少博落回注射液含量测定项，故无法对产品质量进行统一评价，目前市面上的博落回注射液质量参差不齐。鉴于以上现状，在暂未制订含量测定标准的情况下，本研究建立的方法操作简单、快速，方法学各项参数均在可接受范围内，方法重现性较好，适用于评价市售博落回注射液中血根碱和白屈菜红碱两种有效成分含量。4结论本研究方法操作简便、结果可靠、灵敏度高，可用于博落回注射液的有效成分的测定。本试验可为博落回提取物中其他生物碱类成分的检测提供参考，可用于博落回注射液的质量控制。