呕吐毒素（DON）是禾谷镰刀菌等镰刀菌属产生的单端孢霉烯族化合物，是一种真菌毒素[1]，具有很强的毒性。在储存及烹调过程中，DON不会被破坏，耐藏力强[2-3]。近年来，我国饲料及饲料原料中DON的检出率高达96.3%，部分地区DON阳性均值达0.91 mg/kg，超标率很高[4-6]。呕吐毒素的产生和积累使农作物产量大幅下降，损害农产品、饲料和畜产品质量，对人类健康造成极大危害。目前，去除饲料中呕吐毒素的方法主要有物理吸附法、化学处理法和生物降解法等[7]。物理、化学处理法在实际应用中易破坏营养成分，引起二次污染。生物降解法能够通过微生物的活动将饲料中的毒素转化成低毒或无毒的代谢产物，且能够在不影响饲料营养成分及适口性的条件下将饲料中的抗营养因子转化，产生更有利于动物采食和利用的高活性益生菌及其代谢产物[8]。试验拟筛选1株产益生物质且降解呕吐毒素的菌株，并在霉变麸皮中进行效果检测，以期为粮食和饲料的降毒替抗提供更多的微生物种质资源。1材料与方法1.1试验材料养殖场土壤粪便、饲料加工厂以及多年腐熟落叶、河流淤泥等。1.2试剂和仪器呕吐毒素标准品、酶联免疫检测试剂盒、PCR相关试剂均为国产分析纯。1.3供试菌株大肠杆菌（Escherichia coli）、禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum）由本实验室提供。1.4试验方法1.4.1菌株分离称取10.0 g样品加入100 mL无菌水中，150 r/min摇床混匀30 min，取悬液于80 ℃水浴10 min，梯度稀释涂布NA平板，37 ℃培养72 h，平板多次划线挑取单菌落，4 ℃保藏备用。1.4.2菌株筛选参照韩凯会等[9]的方法，筛选出能够拮抗大肠杆菌的菌株进行后续研究。1.4.3呕吐毒素降解菌的筛选将禾谷镰刀菌活化，制作病原菌平板。将上述菌株接种于NB培养基，37 ℃、150 r/min摇床培养48 h，将发酵液8 000 r/min离心20 min，取上清液。采用平板扩散法在病原菌平板上筛选能抑制禾谷镰刀菌生长的菌株。将筛选的菌株发酵液8 000 r/min离心20 min，取1 900 µL上清液与100 µL呕吐毒素（终浓度为1 000 µg/L）混合，28 ℃培养24 h，测定呕吐毒素残留量，与不加发酵上清液只添加呕吐毒素的发酵培养基对照。1.4.4菌株的种属鉴定菌株的形态学鉴定与生理生化鉴定参照参考文献[10]。对供试菌株采用16S rDNA进行分子学鉴定，并对测序结果进行Blast同源性比较，发现菌株10-32基因序列与枯草芽孢杆菌相似度达到99%，建立系统发育树，然后通过与标准菌株的生理生化试验初步确定其种属。1.4.5菌株性质研究将发酵培养基pH值调3.5、4.5、5.5、6.5，以6%的接种量接入培养基中。37 ℃、180 r/min摇床培养24 h，并在600 nm下测定菌株发酵液的吸光值来反映菌株在不同pH值下的生长情况，空白培养基为对照组。将菌株种子液以6%的接种量接种于发酵培养基中，分别在27、37、47 ℃，180 r/min摇床培养24 h，并在600 nm下测定菌株发酵液的吸光值来反映菌株在不同温度下的生长情况。1.4.6菌株发酵麸皮试验试验设置试验组和对照组，试验组接菌量为109 CFU/kg，含水量为40%，压实小瓶发酵，每天任意开3瓶取样测定呕吐毒素的含量；对照组不接菌，其余同试验组。试验期7 d，每天通过酶联免疫法检测麸皮中残留的呕吐毒素含量，并通过抑菌圈法测量第1、3、5、7 d发酵麸皮浸提液对大肠杆菌的抑菌活性。1.5数据统计与分析利用Excel处理基础数据，结果以“平均值±标准差”表示，用SPSS 20.0进行方差分析和多重比较。2结果与分析2.1菌株分离挑取不同形态的菌落在NA平板上划线分离培养，共计1 069株。2.2拮抗大肠杆菌生长的菌株筛选在拮抗大肠杆菌的初筛中总共筛选53株抑菌圈明显的菌株，复筛总共筛选出22株抑菌圈比较明显的菌株。2.3抑制禾谷镰刀菌生长且降解呕吐毒素菌株的筛选平板扩散法显示22株菌里有8株菌对禾谷镰刀菌有较强的抑制作用。将22株菌进行呕吐毒素的降解率试验，其中8株菌的降解率在50%以上，DON降解菌株的筛选结果见表1。菌株R1、2A、10-32、A30的降解率在80%以上，其中10-32的降解率最高，达到96.56%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.020.T001表1DON降解菌株的筛选结果菌株号菌株来源降解率/%JY1多年腐熟落叶65.25±1.15R1多年腐熟落叶95.03±0.532A多年腐熟落叶86.27±0.89A40多年腐熟落叶75.47±0.6710-32养殖场土壤粪便96.56±0.29A30养殖场土壤粪便57.32±0.97B-3养殖场土壤粪便87.67±0.75TM实验室土壤菌株71.69±1.242.4菌株的种属鉴定菌株系统发育树见图1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.020.F001图1菌株系统发育树由图1可知，菌株10-32与枯草芽孢杆菌亲缘关系最近，结合生理生化试验结果判定菌株10-32为枯草芽孢杆菌。菌株10-32的菌落中间隆起、乳白色、不透明、四周有褶皱，芽孢染色为绿色，革兰氏染色为紫色呈阳性。2.5菌株性质研究我国南北气候温度差异较大，要求菌株的生长能够适应不同地区的温度，菌株10-32对温度的耐受性见图2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.020.F002图2菌株10-32对温度的耐受性由图2可知，菌株10-32在温度27~47 ℃范围内正常生长，表明在不同地域、不同季节温度条件下均能发酵。在压实发酵初期会有少量的乳酸产生导致发酵物料的pH值较低，要求发酵菌剂能够适应一定的酸性环境才能生长发挥作用。菌株10-32在不同pH值下的生长情况见图3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.020.F003图3菌株10-32对pH值的耐受性由图3可知，菌株10-32在pH值3.5~6.5之间均能正常生长，表明能够适应发酵过程中pH值较低的环境。2.6菌株发酵麸皮试验（见表2、表3）由表2可知，发酵麸皮在接菌量为109 CFU/kg、调节含水量为40%、压实发酵的情况下，发酵5 d的降解率为73.25%，而对照组在整个过程中呕吐毒素的含量没有显著性变化。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.020.T002表2菌株10-32在发酵麸皮中的降解率发酵天数/d对照组DON含量/（μg/kg）试验组DON含量/（μg/kg）降解率/%02 152.26±29.782 145.43±26.67—12 138.26±32.811 221.34±34.8742.88±0.2422 125.30±39.841 212.79±37.9243.28±0.3432 114.98±43.961 397.33±40.9145.65±0.5742 110.76±40.831 223.80±39.8546.77±0.2752 109.98±35.95809.03±34.9173.25±0.0262 110.23±37.92837.13±36.9460.85±0.0672 107.99±36.88829.59±35.8661.20±0.05由表3可知，在第5 d对大肠杆菌的抑菌活性达到最大，抑菌圈直径为2.1 cm。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.020.T003表3不同发酵天数提取的抑菌活性物质对大肠杆菌的抑菌圈直径发酵天数/d对照组试验组000101.2±0.2301.4±0.3502.1±0.2702.1±0.1注：表中抑菌圈直径未减去打孔直径0.9 cm。cm3讨论全球每年至少有25%的农作物面临真菌毒素污染的问题，真菌毒素从农作物生长期间产生，伴随收获、贮存、加工而积累，最终引发粮食及饲料安全问题。因此，消除或降解饲料及饲料原料中的真菌毒素成为近年来研究的热点[11-12]。目前，国内外针对DON的脱毒方法主要有机械处理法、物理吸附法以及生物脱毒法等[13]。物理吸附法仅是对DON等毒素进行螯合，并未改变毒性大小，且被动物排出后还会对土壤造成二次污染[14-15]。生物脱毒法包括生物吸附法及生物降解法，生物吸附法是利用微生物细胞壁中的葡甘露聚糖吸附毒素，但其吸附作用是可逆的，且依赖于菌体浓度和活性，因此在生产中的应用受限[16]。生物降解法则利用微生物产生的代谢产物，在温和的条件下破坏毒素的毒性基团，从而起到脱毒、降毒的作用。梁含等[17]筛选3株呕吐毒素降解菌，分别是解淀粉芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、植物乳酸菌，其中植物乳酸菌和枯草芽孢杆菌的混合发酵可降解麸皮中71%的DON。付苗苗等[18]从土壤中筛选到一株脓杆菌，发现其发酵上清可降解64.6%的呕吐毒素。本试验筛选出的枯草芽孢杆菌10-32在发酵液上清可降解96.56%的呕吐毒素，效果略优于前人。枯草芽孢杆菌在农业农村部饲料添加剂目录之中，可直接作为饲料添加剂应用于饲料发酵。因为真菌毒素毒性极强且结构稳定，饲料及饲用日粮的脱毒要从预防及管控两方面入手。以防为主、防降结合才能达到使脱毒效果最大化[12]。本试验所筛菌株10-32对禾谷镰刀菌具有有效的抑制作用，通过抑制病原菌的生长减少毒素的产生，且在饲料的发酵和贮存过程中都表现出良好的防霉脱毒能力。在发酵试验中，虽然菌株10-32对呕吐毒素的降解率达到73.25%，但仍需要发酵工艺和发酵条件的优化。本试验旨在达到该菌的开发最大化，为降解粮食及饲料中的呕吐毒素提供更优秀的种质资源。4结论试验筛选到1株高效降解DON的枯草芽孢杆菌10-32，降解率为96.56%；该菌株还可以拮抗大肠杆菌、禾谷镰刀菌的生长。在接菌量为109 CFU/kg、调节含水量为40%、压实发酵的情况下，利用枯草芽孢杆菌10-32发酵麸皮5 d后呕吐毒素的降解率为73.25%，并且发酵麸皮的浸提液对大肠杆菌有较强的抑制活性。