仔猪断奶时生存环境、营养来源改变,自身消化系统发育不完善,容易出现断奶应激。断奶应激表现为生长受阻、腹泻、死亡率高等现象[1]。药理剂量(2 000~4 000 mg/kg)的氧化锌能较好控制动物腹泻[2]。2 500 mg/kg氧化锌可使断奶仔猪腹泻率降低50.00%~63.36%[3]。高剂量氧化锌对腹泻有很好的预防效果,但长期使用高剂量氧化锌会加重仔猪胰腺氧化应激[4],引起动物肠黏膜上皮细胞萎缩、sIgA极显著降低[5]、皮肤苍白、被毛粗乱[6]、生长受阻[7]。同时,过量使用氧化锌会加速微生物产生耐药性[8],造成环境污染。纳米氧化锌与普通氧化锌相比具有比表面积大、吸附性好、抗菌性能优越、使用量小、生物利用度高等特点[4,9-10]。实际应用中,300 mg/kg纳米氧化锌效果与3 000 mg/kg氧化锌效果相当[11]。纳米氧化锌的使用效果容易受多种因素影响。文章综述纳米氧化锌的抑菌机理以及常见影响因素,以期为纳米氧化锌在饲料中的使用提供参考。1纳米氧化锌的抑菌机制据报道,600 mg/kg纳米氧化锌对腹泻的控制以及对仔猪生长性能的提高效果与2 000 mg/kg普通氧化锌效果相当[12]。在断奶仔猪日粮中添加500 mg/kg纳米氧化锌,断奶后1~3周仔猪腹泻率较对照组显著降低28.21%;4~6周仔猪腹泻率较对照组显著降低39.84%。研究表明,仔猪肠道有益菌毛螺菌科、瘤胃菌科、韦荣球菌科和乳酸球菌科丰度上调,链球菌科和普雷沃氏菌科比例下调[13]。纳米氧化锌对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制率分别高达97.9%和98.8%[2],说明纳米氧化锌对肠道菌群调节和病原菌控制方面有较好的效果。目前,关于纳米氧化锌抑菌机制研究主要体现在3个方面:表面接触抑菌、游离Zn2+抑菌和释放自由基抑菌[14]。1.1接触抑菌作用纳米氧化锌粒径一般在1~100 nm,随着粒径减小,纳米氧化锌表面原子数/总原子数比值增加,使其表面效应增加,更易引起细菌损伤。采用100 mg/L纳米氧化锌处理化脓性链球菌悬浮液24 h,可导致细菌细胞壁变皱、细胞膜破裂[15]。Tayel等[16]发现,采用纳米氧化锌处理金黄色葡萄球菌2~4 h,可引起菌体破裂水解甚至完全消失。Wahab等[17]报道,纳米氧化锌与大肠杆菌接触后,可进入菌体内部导致菌体死亡;与肺炎克雷伯杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌接触后,引发菌体变形导致菌体内容物外泄。研究发现,纳米氧化锌与大肠杆菌接触后能以胞吞方式进入菌体发挥杀菌效应[18],这可能与纳米氧化锌的表面效应有关。纳米氧化锌带正电荷且生物相容性良好,与带负电的菌体表面酰胺键、不饱和键结合破坏菌体表面聚糖或蛋白等结构[17,19]。1.2锌离子溶出机制锌离子参与菌体内300多种酶促反应,是DNA、蛋白质、酶、催化剂等的结构稳定剂。锌离子溶出机制通过在外界溶液环境释放锌离子进入菌体发挥抗菌效应[20]。高浓度锌离子会引起菌体内稳态急剧变化而产生细菌毒性[21]。纳米氧化锌在动物体内释放的锌离子能透过细胞膜进入菌体,扰乱膜结构,与电子传递链上的酶系统反应导致细菌死亡,且锌离子从菌体内释后可重复上述杀菌过程[22]。将25~500 mg/L纳米氧化锌分别与大肠杆菌、蜡样芽孢杆菌共同培养,培养液中游离锌离子浓度不足0.12 mg/L,此时大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌存活率分别在84.50%和71.27%以上;在培养液中加入乙酸、乳酸等酸化剂后,培养液中游离锌离子浓度急剧上升,培养液中细菌存活率极显著下降,这是因为小分子酸能够促进锌离子溶出[23]。1.3自由基机制纳米材料诱导产生自由基是其削弱细菌毒性的主要机制之一[24-25]。纳米氧化锌半导体电子带由导带和价带组成。当光子辐射能量大于3.3 eV时被纳米氧化锌吸收,电子从价带转到导带激发光反应,价带上产生空穴(h+),导带上产生自由电子,空穴(h+)会促进羟自由基产生[26]。自由电子和H+与菌体表面氧气、水等结合产生·OH、·O2-等自由基进而发挥杀菌毒性[27]。具体表现为自由基(如H2O2)穿过细胞壁进入菌体内发挥杀菌作用,其他一些带负电超氧化物自由基虽不能进入菌体内,但仍可聚集在菌体表面造成菌体表面损伤[28]。有研究发现,纳米氧化锌和白色念珠菌培养液中自由基含量较高,白色念珠菌生长明显受到抑制,当加入抗氧化剂组氨酸后,自由基含量大大减少,纳米氧化锌对白色念珠菌抑制作用明显削弱[29]。也有研究发现,纳米氧化锌在某些条件下并不能诱导产生自由基,抗氧化剂半胱氨酸的干预并不影响其对大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌的抑制效果[23],以此推测,自由基在某些条件下不是主要抑菌机制。2影响纳米氧化锌抑菌效果的因素不同合成方法以及饲料中常见拮抗因子和协同因子都会影响纳米氧化锌的使用效果。研究纳米氧化锌的合成途径以及与之拮抗、协同相关的营养素对其在饲料中的应用具有重要意义。2.1不同合成途径对抑菌性能的影响纳米氧化锌制作方法主要有物理法、化学法和生物模板法[30]。物理法通过电点火花爆炸、球磨-超声波粉碎-冲击波粉碎等工艺将氧化锌加工至纳米级。但物理法制作的纳米氧化锌纯度低,得不到1~100 nm粉体,可以通过静压塑形达到粒度可控、纯度高的效果,但其对设备要求较高。化学法合成途径较多,如气相法、固相法和液相法等。化学法是将锌盐或锌粉在一定状态下发生化学反应后再煅烧,不同的合成途径所获得成品差异较大,如气相氧化法获取的纳米氧化锌粒径虽可低至10~20 nm,但纯度低、原料残留率高;其他化学途径合成也会导致粒径不均匀、分散性差或存在阴离子杂质等[31]。生物模板法是指利用微生物、酶和植物提取物制成纳米颗粒生物模板,用于合成纳米氧化锌的新型手段[32],该方法污染小、成本低。不同的合成途径所得产物性质存在较大差异。以化学法中直接沉淀和均匀沉淀法为例,2种方式均需300~400 ℃高温煅烧[33-34],对比成品发现,后者所得纳米氧化锌颗粒均匀度高、结晶完整,对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌等抑菌圈直径均优于前者[33]。而藤茶黄酮采用生物模板法与ZnSO4·7H2O经配位、煅烧制得的纳米氧化锌抑菌能力较化工合成的纳米氧化锌提升50%[35]。即使采用同样的合成方法,煅烧温度不同对纳米氧化锌品质也有较大影响,如直接沉淀法在350~450 ℃煅烧所得粒径为20~25 nm,500 ℃煅烧所得粒径在100 nm以上,且分散性差[33]。2.2拮抗因子氧化锌拮抗因子主要包括酸碱环境和金属离子。有研究发现,50 mg/L纳米氧化锌悬浮液在pH值5.5~8.0时可导致80%~90%的大肠杆菌死亡,当pH值升至8.7时,大肠杆菌死亡率降至10%[19]。虽然在pH值5.5~8.0范围内纳米氧化锌有良好抑菌效果,但腐殖酸络合锌离子会使纳米氧化锌抑菌能力被削弱[19]。采用PBS缓冲液、MD或LB培养液时,纳米氧化锌对大肠杆菌抑菌能力相比其在超纯水或0.85%NaCl中减弱,主要因为纳米氧化锌释放出的锌离子与PBS缓冲液中的磷酸根结合形成Zn3(PO4)2,而MD培养液中的柠檬酸和LB培养液中的氨基酸与锌离子络合[36]。在磷酸盐作用下,纳米氧化锌的球形结构会转化为含有磷酸锌和氧化锌混合物的多孔结构[37],削弱其抑菌效果。植酸、单宁酸、海藻酸、富里酸等因络合作用也会拮抗纳米氧化性抑菌效果[38]。部分金属离子同样会拮抗锌离子在体内效价发挥。高锌日粮虽然能促进Zn2+在断奶仔猪肝肾等组织器官沉积,但降低了Cu2+、Fe2+在脾脏、胸腺、心脏等部位的含量,制约机体血红素的合成,导致仔猪贫血[39],这与Cu2+在肠黏膜与Zn2+竞争结合位点、Fe2+与Zn2+竞争内源性配体以及离子通道有关[40]。2.3协同因子日粮中除常规矿物元素(如锰)能促进Zn2+吸收外,部分添加剂也能促进纳米氧化锌生物效价发挥。有研究发现,日粮中添加植酸酶可极显著增加仔猪血清锌水平并改善仔猪日增重[7]。Walk等[41]研究发现,日粮中超剂量添加植酸酶能减少锌(750 mg/kg)的添加,促进断奶仔猪生长,且对仔猪腹泻不产生负面影响。因为植酸酶能酶解植酸盐,减少植酸与锌的络合作用,使饲料中的锌被充分利用[42]。挥发性短链脂肪酸也可以促进纳米氧化锌的抑菌效果,将25~500 mL/L纳米氧化锌分别加入大肠杆菌和蜡样芽孢杆菌,两者存活率分别在84.5%和71.27%以上,再加入乙酸、乳酸、丙酸或异丁酸会使两者存活率大大降低。电镜图显示酸性物质的加入会导致菌体变形,内容物外泄,且以乳酸效果最佳,因为短链脂肪酸会促进纳米氧化锌释放Zn2+,使其抑菌性能大大提升[38]。纳米氧化锌与植物乳杆菌发酵液混合后对鼠伤寒沙门氏菌抑制效果优于纳米氧化锌,动物试验表明,两者混合后小鼠肠道菌群丰度上调,致病菌的协同抑制性增加,断奶仔猪生长性能改善,腹泻率降低。这是因为植物乳杆菌发酵液中富含乳酸等小分子酸,能与纳米氧化锌协同增效[43]。益生菌在使用过程中易受饲料加工[44]、动物胃酸、胆盐[45]等因素影响而降低活性,但益生元可有效规避以上不足,且能有效调节肠道益生菌丰度,如人参多糖可使乳酸菌的含量提升144倍、增加产乳酸等小分子酸能力[46]、下调拟杆菌属等丰度、重塑肠道菌群、缓解肠水肿、减少腹泻[47]。因此,纳米氧化锌与人参多糖等益生元或植酸酶类添加剂联用可能起到协同增效的作用。3展望纳米氧化锌通过纳米粒子直接接触、释放锌离子以及自由基等方式对病原微生物有较好的抑制效果,且不同合成方式以及饲料中存在的拮抗或协同因素会影响其应用效果。因此,除了需考虑其合成方式外,饲料配方应适当减少因络合或竞争性结合位点效应而削弱纳米氧化锌功效;还应重视协同因子的合理使用,如植酸酶、益生菌、益生元等具有水解络合剂或促进锌离子释放物质。未来可进一步研究纳米氧化锌与功能性添加剂联用的效果。

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