红螯螯虾（Cherax quadricarinatus）个体大、出肉率高、味道鲜美、适应性强、病害少。有研究人员对红螯螯虾的蛋白质、脂肪、维生素等需求量进行研究[1-7]。近年来，本课题组针对海南热带、亚热带气候养殖条件，对红螯螯虾幼虾的蛋白质、脂肪等需求量以及鱼粉替代量、适宜脂肪源、适宜糖源等方面进行了研究[8-12]，以期逐步研制红螯螯虾专用人工配合饲料。光合细菌（PSB）是一类富含类胡萝卜素、辅酶Q、维生素和矿物质等营养的有益微生物，常用于养殖污水净化处理[13-14]与生物制氢[15-16]。研究表明，在饲料中添加PSB制剂能够显著提高水产动物的生长性能与免疫力[17-23]。本课题组在南海样本中富集纯化获得一株PSB菌株，该菌株具有较强的水质净化活力[24]。本试验研究饲料中添加不同浓度PSB菌液对红螯螯虾幼虾生长性能、消化功能与免疫力的影响，以期进一步完善红螯螯虾配合饲料配方。1材料与方法1.1试验日粮基础日粮组成及营养水平见表1。配料后，将准备好的原料粉碎，过80目筛网，按配方比例精准称重并混合均匀，使用制粒机制成颗粒饲料，放入烘箱烘干（60 ℃），塑封袋包装后放入-20 ℃冰箱保存。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.015.T001表1基础日粮组成及营养水平原料组成含量营养水平合计100.0鱼粉6.0粗蛋白30.86豆粕26.0粗脂肪7.72血粉7.0花生麸20.0蔗糖10.0玉米淀粉10.0氯化钠0.1复合维生素1.0复合矿物质1.0氯化胆碱0.5贝壳粉1.0磷酸二氢钙1.5海藻酸钠2.0大豆油3.0花生油3.0α-纤维素7.9注：1.每千克复合维生素含：VA 9 000 000 IU、VB1 2 000 mg、VB2 5 000 mg、VB6 5 000 mg、VB12 20 mg、VC 8 000 mg、VD3 1 000 000 IU、VE 18 000 IU、VK3 2 000 mg、烟酸18 000 mg、叶酸300 mg、泛酸钙7 000 mg、生物素45 g。2.每千克复合矿物质含：MnSO4 15 g、CuSO4 2 g、KI 0.04 g、ZnSO4 25 g、Fe2(SO4)3 25 g、CoSO4 0.1 g、Na2SeO3 0.02 g。%1.2光合细菌培养试验所用PSB菌株为本研究组在南海海域筛选到的一株红假单胞菌[24]。按配方配置培养基：无水乙酸钠1.0 g/L、酵母膏1.0 g/L、蛋白胨0.2 g/L、氯化铵0.5 g/L、七水合硫酸镁0.2 g/L、氯化钠1.0 g/L、氯化钙0.05 g/L、一水合硫酸锰0.002 5 g/L、磷酸二氢钾0.3 g/L、磷酸氢二钾0.3 g/L、pH值7.2±0.2。培养基灭菌冷却后，以20%的接种量接种，光照培养箱温度30 ℃、光照强度3 000 lx培养96 h以上，菌体浓度用超纯水调整到1×1010 个/mL后使用。1.3投喂试验试验用红螯螯虾幼虾购自海南省海口市三江镇。养殖试验于室内循环水养殖系统中进行，幼虾在水温27~31 ℃、pH值7.8、持续爆气增氧的环境下暂养1周，挑选规格均匀[平均体重（0.58±0.04）g]、无断肢、无外表病症、活力正常并处于蜕皮间期的幼虾进行养殖试验。试验设置4组，分别是3个不同PSB菌液喷涂浓度（1%、3%、5%）的处理组和不喷涂光合细菌菌液的对照组，每组设置3个平行。养殖箱规格为100 cm×100 cm×100 cm，水深60~65 cm。每个养殖箱养殖30尾虾，放置30个PVC管遮蔽物。按照设置的添加浓度均匀喷洒PSB菌液在基础日粮表面，在阴凉处放置1 h后使用。每天的投喂量约为虾体重的6%，根据螯虾的实际摄食情况进行调整，每天分2次投喂。饲养试验周期为8周。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能养殖试验结束前1 d停止投喂。养殖试验结束将虾全部捞出计数、称重，按下列公式计算生长性能指标：存活率=终末数量/初始数量×100%(1)增重率=(Wt-W0)/W0×100%(2)特定生长率=(lnWt-lnW0)/t×100%(3)式中：Wt为平均终末体重；W0为平均初始体重，t为试验天数。螯虾称重后，立即用灭菌的镊子取其肝胰腺，放入预冷1.5 mL离心管中，液氮速冻，置于-80 ℃冰箱中保存备用。1.4.2酶活力将肝胰腺样品于-80 ℃冰箱中取出称重，在冰浴上解冻，加入9倍体积的预冷生理盐水（0.85%NaCl），利用超声波细胞破碎仪（SCIETZ-ⅡD，宁波新芝生物科技股份有限公司）将样品在冰浴中进行匀浆（工作时间3 s，间歇时间3 s，工作次数10次），4 ℃、10 000 r/min离心10 min，取上清液作为待测肝胰腺悬液。每尾虾的肝胰腺悬液作为一个单独样本进行酶活力测定。消化酶测定胰蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，免疫相关指标测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、碱性磷酸酶（AKP）和酸性磷酸酶（ACP）、总抗氧化能力（T-AOC）、蛋白质含量，上述指标均采用南京建成检测试剂盒测定。1.5数据统计与分析数据利用SPSS 18.0进行单因素方差分析（One-way ANVOA），结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1PSB对红螯螯虾生长性能的影响（见表2）由表2可知，与对照组相比，PSB添加量为3%和5%的螯虾增重率和特定生长率显著提高（P0.05），添加量为3%时，增重率和特定生长率最高。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.015.T002表2PSB对红螯螯虾生长性能的影响项目对照组1%PSB组3%PSB组5%PSB组初重/g0.57±0.050.56±0.040.59±0.030.59±0.05末重/g2.82±0.432.90±0.173.51±0.083.50±0.31增重率/%391.17±37.01b416.38±13.01ab495.99±47.87a490.16±32.01a存活率/%78.89±6.9475.56±9.6281.11±6.9477.78±8.39特定生长率/(%/d)2.65±0.12b2.74±0.04ab2.97±0.13a2.96±0.09a注：同行数据肩标小写字母不同表示差异性显著（P0.05），小写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2PSB对红螯螯虾肝胰腺消化酶活力的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，各PSB添加组螯虾肝胰腺的胰蛋白酶活力均显著提高（P0.05）。添加PSB对脂肪酶和淀粉酶活力无显著影响（P0.05）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.015.T003表3PSB对红螯螯虾肝胰腺消化酶活力的影响项目对照组1%PSB组3%PSB组5%PSB组胰蛋白酶/(U/mg prot)7 663.23±893.08b9 292.14±1167.81a9 419.63±900.68a9 235.22±797.97a脂肪酶/(U/g prot)17.51±2.8418.25±2.7317.86±1.9019.16±2.79淀粉酶/(U/mg prot)0.111±0.0090.108±0.0090.102±0.0120.108±0.0102.3PSB对红螯螯虾肝胰腺免疫相关酶活力的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，PSB添加量为3%和5%的螯虾肝胰腺T-AOC显著提高（P0.05）。随着PSB添加量的升高，GSH-Px活力呈现先升高后下降的趋势，PSB添加量为3%的螯虾肝胰腺GSH-Px活力显著高于对照组（P0.05）。PSB添加量为3%和5%的螯虾肝胰腺AKP活力显著提高（P0.05）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.06.015.T004表4PSB对红螯螯虾肝胰腺免疫相关酶活力的影响项目对照组1%PSB组3%PSB组5%PSB组T-AOC/(U/mg prot)4.37±0.65b5.38±1.20ab6.36±0.74a6.43±0.63aSOD/(U/mg prot)2.62±0.562.76±0.342.76±0.402.52±0.62GSH-Px/(U/mg prot)253.07±20.02b261.87±14.62b305.57±30.66a287.78±18.59abACP/(U/mg prot)0.20±0.020.19±0.030.20±0.030.17±0.02AKP/(U/mg prot)0.14±0.01b0.17±0.01ab0.18±0.02a0.19±0.03a3讨论3.1PSB对水产动物生长性能的影响PSB可作为天然的安全的营养增强剂，能够促进水产动物生长。虎龙斑（Epinephelus fuscoguttatus ♀×E. lancedatiis♂）幼鱼饲料中添加1%和5%的PSB菌液能够显著提高其生长性能，显著降低饲料系数[17]。在西伯利亚鲟鱼饲料中添加1.0%~3.0%PSB菌液，鱼的增重率显著提高，增重率随着PSB添加量的升高而升高；当添加量为3%时，增重率比对照组提高62.72%[18]。在饲料种添加1.0%~3.0% PSB菌液，卵形鲳鲹生长性能随着添加量的增加而呈现先上升后下降的趋势，添加量为2%时生长性能显著提高[19]。在稚鳄龟饲料和养殖水体中同时添加光合细菌可显著提高其生长性能和存活率，降低饵料系数[20]。饲料中添加1%和5%的PSB菌液可促进鲫鱼和罗非鱼的生长性能[22]。饲料中添加5%的PSB菌液能提高月鳢的生长性能，降低饵料系数[23]。在每克饲料喷涂0.1 mL PSB菌液，凡纳滨对虾其生长性能略有提高，但是试验的养殖周期仅为2周，结果可能与其养殖周期较短有关[25]。本研究发现，PSB添加量达3%能够显著促进红螯螯虾幼虾的生长，与以往的研究结果相似。PBS对红螯螯虾在正常养殖状态下的存活率没有显著影响，在攻毒或者胁迫状态下，是否起到保护作用仍有待进一步研究。综合前人研究结果，PSB在水产动物饲料中的适宜添加量在1%~5%之间，不同的品种之间存在差异。PSB的营养成分十分丰富，蛋白质含量超过酵母、小球藻和大豆，其VB12、叶酸和生物素等B族维生素含量也尤其丰富，还含有丰富的类胡萝卜素及辅酶Q等生物活性物质[26]，饲料中添加PSB对水产动物肠道菌群与消化功能的调理作用，可能是其促生长的重要因素之一[21,25]。有研究发现，PSB对尖吻鲈的生长没有显著影响[27]。该研究选用的PSB是荚膜红假单胞菌PS2菌株，可能与PSB的种类、菌株特性具有专一性以及添加量有关。3.2PSB对水产动物消化功能的影响饲料中添加PSB能够对水产动物的消化酶活力产生影响。饲料中添加PSB可显著提高肠道胰蛋白酶和淀粉酶活力[17]。添加PSB明显提高西伯利亚鲟鱼消化道内的蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力[18]。饲料添加PSB能够提高鲤肠道中的淀粉酶和蛋白酶活力[21]。饲料中添加红假单胞菌菌液和红螺菌菌液可显著提高凡纳滨对虾肝胰腺淀粉酶活力，添加市售PSB菌液与这两株菌的菌液均能使脂肪酶活力显著提高，但对蛋白酶活力没有显著影响[25]。在本研究中，添加PSB显著提高红螯螯虾幼虾肝胰腺胰蛋白酶活力，但对脂肪酶和淀粉酶活力没有显著影响。不同物种的研究结果有一定差异，选用PSB菌株不同也可能是产生差异结果的主要原因之一。3.3PSB对水产动物免疫力的影响环境中PSB可以净化水质，改善环境，抑制环境中致病微生物的过度繁殖[22,28]。饲料中添加PSB可增强水产动物的免疫力[17,29]。饲料中添加PSB能显著提高虎龙斑血清总蛋白含量、碱性磷酸酶与溶菌酶活力、还原型谷胱甘肽活力及哈维氏弧菌攻毒成活率[17]。在饲料中添加PSB可显著提高鲫鱼与罗飞鱼血清溶菌酶活力[22]。饲料中喷涂1%的光合细菌复合制剂可显著提高草鱼血清抗菌活性、血清和肝脏总SOD活力[29]。但添加PSB对尖吻鲈血清SOD、POD和AKP活力无显著影响[27]。本研究中，PSB添加量达3%以上时，红螯螯虾T-AOC、GSH-Px和AKP活力显著提高，但PSB的添加对肝胰腺SOD、ACP的活力均无显著影响。PSB提高了红螯螯虾的总体抗氧化水平，一方面刺激机体GSH-Px活力的上升，另一方面可能由于PSB提供的一些含有共辘双键等特殊结构的活性成分，如类胡萝卜素、泛醒类化合物、泛酸等，从而提高机体对氧自由基的淬灭和稳定作用[30]。在饲料中添加PSB对不同种类水产动物有不同的效果，这可能与所用的PSB的菌株特性、用量等相关。4结论试验选用的PSB菌株对红螯螯虾幼虾生长性能、蛋白酶活力、GSH-Px和AKP活力及T-AOC均有显著促进作用，其适宜的添加量为3%。