酒糟酵母培养物属于非纯净酵母培养物，通常由白酒糟发酵处理得到。酒糟酵母培养物含有能为机体提供营养的培养基、营养盐等物质，还含有酵母菌发酵后的各类次级代谢产物，如功能性的生长因子、增强免疫的功能的物质。存留的酵母菌和其他有益菌可以发挥功效[1]。白酒糟酵母培养物能够应用于各类动物的饲料中，发挥微生物制剂的功效[2-3]，同时提高资源的利用率。孟繁伊等[4]研究发现，酒糟酵母中的这类功能的生长因子可以改善鮰鱼（Leiocassis longirostris）的生长性能，提高免疫力[5]。酒糟酵母在龙胆石斑（Leiocassis longirostris）[6]、异育银鲫（Leiocassis longirostris）[7]上也有类似研究。Sarasquete等[8]和Ben等[9]研究发现，鱼类除依靠自身分泌消化酶代谢食物，还需要依靠外环境和体内的微生物共同作用以促进代谢的完成。在这个过程中，体内的微生物依靠鱼体生存，彼此互利[10]。饲料中添加低聚果糖能够增加罗非鱼（Oreochromis spp.）肠道中乳酸菌丰度、降低大肠杆菌的丰度[11]。在草鱼饲料中添加胆汁酸[12]、在红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）饲料中添加壳聚糖[13]、在凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）饲料中添加玉米秸秆[14]都能改变体内特定种类肠道微生物丰度。本试验利用白酒糟酵母培养物全价替换草鱼的配合饲料，探究其是否对草鱼的生长和肠道菌群有所影响，为酒糟酵母在水产养殖中的应用提供参考。1材料与方法1.1试验饲料基础饲料使用海大集团草鱼专用配合饲料2号料，试验分别用白酒糟酵母培养物全价代替0%、8%、10%、12%、16%的基础饲料。配制饲料前先将基础饲料充分粉碎，过40目筛，将称好定量的酒糟酵母培养物加入基础饲料，加入1%黏合剂即羧甲基纤维素钠，人工充分混合均匀，加入原料总量30%的水分转入搅拌机中混匀。使用学院的小型饲料机制作成直径约4.5 mm的颗粒的饲料。将制好的饲料自然风干，分别储存在-20 ℃的冰箱中备用。酒糟酵母培养物中氨基酸的组成见表1，酒糟酵母培养物营养水平见表2，酒糟酵母培养物部分替换饲料后各组饲料营养水平见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.T001表1酒糟酵母培养物中氨基酸的组成项目胱氨酸色氨酸天门冬氨酸苏氨酸丝氨酸谷氨酸含量0.250.171.660.680.823.77项目甘氨酸丙氨酸缬氨酸蛋氨酸异亮氨酸亮氨酸含量0.81.351.100.370.542.05项目酪氨酸苯丙氨酸赖氨酸组氨酸精氨酸脯氨酸含量0.540.940.880.630.671.20%10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.T002表2酒糟酵母培养物营养水平项目实测值标准值水分/%11.9≤12.50粗蛋白/%20.2≥20.00粗纤维/%7.6≤10.00粗灰分/%9.3≤10.00霉菌总数/（CFU/g）400.0≤4000010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.T003表3各组饲料营养水平项目粗蛋白干物质总磷灰分粗脂肪对照组33.6691.921.509.698.998%替换组31.7990.191.419.556.3710%替换组30.0289.601.3711.318.4412%替换组30.7490.911.3011.498.0716%替换组28.6289.831.2611.387.29%1.2试验设计试验鱼购自团风百容水产基地，选取体格健壮、无病无害初始体重为（99.5±0.5）g的草鱼，随机分成5组，每组3个重复，每个重复30尾鱼。整个饲养期间保持水质稳定，水温控制在24~28 ℃、溶氧5.0 mg/L以上，pH值6.8~7.5。整个试验期10周，每天9：00和16：00各投喂1次饲料。试验日粮按照鱼体重的3%~5%投喂（日投饲量按照鱼的摄食情况和水温具体具体制定）。1.3样品采集和制备1.3.1样品采集养殖试验结束后，分别在每个重复中随机选取3尾鱼。在经过灭菌处理的操作盘中取出草鱼的肠道，用无菌镊子轻轻挤出前、中、后肠的内容物，在无菌称量纸上混合均匀，分3份分别装入冻存管中，立即放入液氮罐中，待采样全部完成后，转入-80 ℃冰箱中，保存备用。1.3.2肠道内容物DNA的提取运用CTAB/Nacl菌株提取法对5个试验组的草鱼肠道微生物宏基因组进行提取。1.3.3肠道微生物16sDNA的扩增肠道微生物的引物设计为微生物通用引物338F-806R，测序区域为V3+V4。1.4测定指标及方法1.4.1生长性能记录各试验组草鱼初重、末重、死亡数、饲料摄入量、体长。计算成活率、饵料系数、增重率、肥满度、内脏指数。成活率=死亡数/组内总尾数(1)饵料系数=F/(W1-W0)(2)增重率=(W1-W0)/W0 (3)肥满度=W1/L3×100%(4)内脏指数=W2/W1×100%(5)式中：W0为试验开始前草鱼体重（g）；W1为试验结束后草鱼体重（g）；W2为试验结束后草鱼内脏团重（g）；F为草鱼饲料摄入量（g）；L为草鱼体长（cm）。1.4.2Miseq测序肠道微生物的16sDNA V4高变区进行扩增，利用Miseq测序平台对目的片段进行高通量测序，并对结果进行生物信息学统计分析。测序由诺和致源生物公司完成。对所测得的肠道微生物全部的reads，与NCBI中已知的细菌DNA序列进行比对[15]。通过相似性和系统发育判定所测得的微生物的种属。1.5数据统计与分析利用R语言软件对各样品OTUs进行韦恩图分析，利用Student's T-Test软件进行组间OTUs、肠道微生物物种丰度的差异显著性分析，P0.05表示显著差异。2结果与分析2.1酒糟酵母培养物替换饲料对草鱼的生长性能的影响（见表4）由表4可知，各替换组草鱼增重率显著高于对照组（P0.05），12%替换组草鱼增重率显著高于8%、10%替换组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.T004表4酒糟酵母培养物替换饲料对草鱼的生长性能的影响组别成活率/%饵料系数增重率/%肥满度/(g/cm3)内脏指数对照组87.66±0.381.95±0.24141.11±7.39a1.80±0.036.58±0.398%替换组89.33±0.251.65±0.05165.10±3.51b1.80±0.046.85±0.4910%替换组90.21±0.191.71±0.10165.10±0.52b1.91±0.056.95±0.4012%替换组88.74±0.371.85±0.23176.60±1.31c1.76±0.056.85±0.3016%替换组87.52±0.461.56±0.02169.96±2.18bc1.84±0.057.39±0.51注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），相同小写字母或无字母表示差异不显著（P0.05）。2.216s DNA V4高变区PCR扩增草鱼肠道微生物的16s DNA V4高变区扩增结果见图1。由图1可知，各试验组的草鱼到微生物高变区扩增结果正常，达到测序要求。图1肠道微生物16s DNA的PCR产物10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F00110.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F0022.3Miseq测序数据统计使用Flash对每个样本Miseq PE数据进行连接，去除无法连接的PE reads，过滤掉连接后低质量的reads，样品测序数据统计见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.T005表5样品测序数据统计样品下机序列数有效序列数有效百分比/%有效序列的碱基总数有效序列的平均长度/bp样品下机序列数有效序列数有效百分比/%有效序列的碱基总数有效序列的平均长度/bp2-137 47830 51881.429 105 0713 291 796435.549-236 77331 68386.158 322 6813 840 757436.852-237 13131 25784.180 334 4913 682 340437.749-335 22630 81687.480 838 0213 460 894436.822-349 80742 89986.130 463 5918 708 764436.1110-143 85839 54190.156 869 9017 013 892430.283-139 07632 15782.293 479 3714 051 887436.9810-242 09133 78380.261 813 6914 805 532438.253-238 51132 70884.931 577 9914 274 325436.4211-151 73843 48184.040 743 7519 083 574438.893-344 93237 67783.853 378 4416 550 635439.2811-247 27543 03991.039 661 5518 836 078437.654-139 50431 67480.179 222 3613 849 956437.2711-342 69136 83079.157 868 5916 259 161441.474-247 51040 99886.293 411 9118 005 308439.1812-143 78840 31292.061 752 0817 763 537440.654-347 62839 98883.959 015 7117 658 227441.5912-241 93737 09488.451 725 2116 229 152437.515-140 91232 51579.475 459 5214 085 886433.2113-149 16741 91085.240 100 0718 284 592436.285-246 70538 63982.729 900 4416 944 617438.5413-251 00643 00384.309 689 0618 761 969436.295-349 78743 40187.173 358 5119 053 452439.0113-348 63641 02584.351 097 9518 113 014441.516-141 04235 05185.402 758 1515 410 084439.6514-138 63332 44383.977 428 6214 106 694434.816-240 25531 86579.157 868 5913 771 753432.1914-252 24342 48881.327 641 9818 523 345435.976-343 30134 98180.785 663 1515 130 117432.5214-336 22330 18983.342 075 4813 215 244437.757-143 53837 60386.368 230 0516 481 079438.2915-143 22035 23981.534 012 0315 427 119437.797-238 88333 32685.708 407 2714 505 338435.2615-236 51330 41883.307 315 2013 374 773439.77-347 61242 92690.157 943 3818 836 458438.8115-347 66741 14486.315 480 3117 874 289434.438-135 76533 20792.847 756 1914 373 770432.8516-151 46744 62586.706 044 6519 512 724437.268-249 47142 59686.102 969 4218 674 306438.4116-240 83735 75487.552 954 4315 657 175437.918-338 00330 35179.864 747 5213 255 788436.7516-348 19342 73688.676 778 7918 694 802437.459-137 18132 30286.877 706 3614 187 511439.21由表5可知，试验提取的DNA样本为43个并对样本进行测序，共测出原始序列1 863 214条。其中，有效序列1 586 192条，有效率为85.13%，有效序列条数在30 189~44 625之间，平均有效序列条数为36 888条，有效序列碱基个数在13 215 244~19 512 724个之间，平均有效碱基个数为16 130 737个，有效序列的平均长度在之间430.28~441.59 bp，平均有效长度为437.22 bp，根据16sDNA V3~V5区的长度，测得的有效片段完全符合要求。2.4OTUs分析2.4.1不同饲料组的OTUs分析（见图2）测序得到的样品中微生物信息量庞大，为了便于总结其生物多样性，将获得的所有有效序列进行聚类统计。以97%的一致性（Identity），将序列聚类成为OTUs（Operational Taxonomic Units）结果。测序的43个样本来自5个试验组，分别进行5个组OTUs的统计。由图2可知，5个组共得到20 995个OTUs。其中，对照组4 546个OTUs，8%替换组3 741个OTUs，10%替换组3 779个OTUs，12%替换组3 049个OTUs，16%替换组5 880个OTUs，各组之间的OTUs数量差距明显。5个试验组共同的OTUs为724个。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F003图2不同饲料组的OTUs分析2.4.2OTUs的分类根据分类单元将通过注释的物种进行分类，依次在门、科、属水平上分类整理。2.4.2.1草鱼肠道微生物在门水平上的物种组成（见图3）由图3可知，5个试验组草鱼的肠道微生物由45个细菌门、1个广古菌门组成。拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁杆菌门（Firmicutes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）在5个试验组中共同出现，并且细菌的数目占该组总的细菌数目的比例5%的门水平分类单元。在门水平上没有比对出的OTUs占总的OTUs数的比例在0.33%~3.83%之间，说明在门水平上未知的新物种的种类较少。样本根据饲喂的相同饲料进行合并（如：2-1、2-2、2-3合并为样本2），合并后取平均值，其中2，3，4（对照组）、5，6，7（8%替换组）、8，9，10（10%替换组）、11，12，13（12%替换组）、14，15，16（16%替换组）。各试验组草鱼饲喂肠道微生物在门水平上的分布没有出现显著性差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F004图3草鱼肠道微生物在门水平上的物种组成2.4.2.2草鱼肠道微生物在科水平上的物种组成（见图4）5个试验组得到353个科。科种类多样性最多的是变形菌门（Proteobacteria），有111个科。种类比较丰富的还有放线菌门（Actinobacteria）有48个科、厚壁杆菌门（Firmicutes）有38个科、绿弯菌门（chloroflexi）有31个科、拟杆菌门（Bacteroidetes）有19个科。由图4可知，12%替换组的肠道中微生物中，放线菌门（Actinobacteria）的分枝杆菌科（Mycobacteriaceae）比例明显上升，另外在厚壁杆菌门（Firmicutes）中也有两个属数量明显增加，分别为红椿科（Coriobacteriaceae）和乳杆菌科（Lactobacillaceae）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F005图4草鱼肠道微生物在科水平上的物种组成2.4.2.3草鱼肠道微生物在属水平上的物种组成（见图5）由图5可知，43个样本中共获得605个属。属种类多样性最丰富的是变形菌门（Proteobacteria），有233个属。另外，种类比较丰富的还有厚壁杆菌门（Firmicutes）95个属、放线菌门（Actinobacteria）78个属、拟杆菌门（Bacteroidetes）41个属、绿弯菌门（chloroflexi）31个属，与科水平相比，变形菌门、厚壁杆菌门在属水平上物种多样性增加明显，绿弯菌门在属水平没有出现明显的增减趋势。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F006图5草鱼肠道微生物在属水平上的物种组成分类结果的属种类分布中，8%试验组草鱼肠微生物种类中苍白杆菌属（Ochrobactrum）种类明显增加；而10%试验组是乳球菌属（Lactococcus）的种类增量显著；12%试验组在分枝杆菌属（Mycobacterium）、乳杆菌属（Lactobacillus）、红椿菌属（Coriobacteriaceae）占比更具优势；16%试验组种类最丰富的属是变形菌门沙雷氏菌属（Serratia）。替换量的不同，草鱼肠道微生物的多样性、物种丰度和种类发生变迁。2.5各样品菌群主要种属的heatmap聚类图（见图6）为显示主要属是否在不同类样本间出现明显差异，挑选属级分类上，在1个样本内的丰度大于1%的属级分类及其相应的丰度进行聚类。由图6可知，从上面的聚类图中发现属级分类上主要是醋酸杆菌属（Acetobacterium）和拟杆菌属（Bacteroides），相同处理条件下，没有发现样本明显聚集的情况。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.015.F007图6各样品菌群主要种属的heatmap聚类图3讨论3.1肠道微生物的群落组成差异分析鱼类肠道微生物群体庞大且复杂，不同鱼的肠道位置微生物的种类和数量存在较大的差异。本试验的韦恩图中可以发现，5个试验组间微生物出现相当数量的交集，但每组都还存在大量的独有微生物物种，这可能与所喂饲料有关。每个酒糟酵母培养物替换组下饲料本身所含有的菌种的数量和种类都不相同。研究表明，鱼类肠道微生物的种类和数目除了与自身的身体状况相关，还与饲养的外界条件有关[16]。本试验中，草鱼生长在相同的水循环系统中，外界环境相似，酒糟酵母培养物替换量的不同成为影响肠道微生物的重要因素。本试验根据草鱼特有肠道特点，将草鱼的肠道分前、中、后肠进行样品采集，样品的采集在试验鱼饥饿处理24 h后，采样时前肠采样部分试验鱼肠道内没有食物。宏基因组DNA提取是将前、中、后肠合并成一个样本进行提取的，3个不同肠段内容物含量会影响样品中微生物的种类和丰度。3.2酒糟酵母培养物部分替换饲料对肠道微生物的群落组成的影响本试验研究结果显示，5个试验组草鱼的肠道微生物菌落结构主要由厚壁杆菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、梭杆菌门（Fusobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）这4种门单位组成的。厚壁杆菌门（Firmicutes）是革兰氏阳性菌，通常与拟杆菌门（Bacteroidetes）组成一对检验指标，两者反映身体的肥胖状况，当身体中的厚壁杆菌门明显多于拟杆菌门时，身体将出现肥胖。这两类细菌不仅在人类的营养和消化吸收上起重要作用，同样对鱼类和哺乳动物营养物质的消化吸收起调节作用[17]。本试验中，5个组的厚壁杆菌门/拟杆菌门分别是1.31、1.73、2.58、0.96、2.11，呈现出先上升后下降的趋势，在12%替换组最低，说明适量的酒糟酵母培养物能够调节草鱼肠道中这两类细菌的比例，使鱼体保持良好的形体和肥满度。梭杆菌门是一个小类群的革兰氏阴性细菌，能导致一些疾病。变形菌门是细菌中分布最广的一个门，含有许多的病原菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、霍乱弧菌、幽门螺杆菌等。在门的水平上，梭杆菌门和变形菌门与其他微生物菌门之间的差异不显著，但在科和属的水平上，变形菌门的物种丰度明显增加，但是在12%替换组显著不同，其在科和属的水平上都是厚壁杆菌门红椿菌属（Coriobacteriaceae）、放线菌门的分枝杆菌属（Mycobacterium）和乳杆菌属（Lactobacillus）的微生物数量明显上升。其中，分枝杆菌属是以致病微生物为主，而乳杆菌属则是以益生菌中的乳酸菌为主，它们间的数量比例将影响草鱼肠道的健康状态。4结论适量的酒糟酵母培养物替代基础饲料能促进草鱼生长性能的提高，在一定程度改善肠道菌群结构，使有益菌比例上升。