黄花蒿（Artemisia annua L.）是一种药用价值极高的传统中草药，内服可清热解暑、截疟凉血，外敷可治疗皮肤瘙痒和脂溢性皮炎等[1]。植物多糖主要存在于细胞壁，由多个单糖分子通过糖苷键连接而成[2]，具有促生长、抗炎症、抗氧化和抗应激等多种生理活性[3]。植物多糖含有多种维生素、微量元素、氨基酸以及未知生长因子，能够改善肠道微生物的生态平衡，提高肠道氨基酸的消化和利用，提高畜禽生长性能[4]。在肉鸡日粮中添加黄芪多糖可以提高肉鸡免疫功能和抗氧化机能，促进肉鸡生长，改善饲料报酬，减少死亡率[5]。在蛋鸡基础日粮中添加黄芪多糖能够显著提高蛋鸡的产蛋性能[6]。杨兵等[7]研究表明，在日粮中添加牛膝多糖能显著提高仔猪血清谷胱甘肽过氧化物酶活性和总抗氧化能力，改善仔猪氧化应激。王建东等[8]研究表明，给高龄蛋鸡饲喂枸杞多糖可提高蛋鸡血清免疫球蛋白含量，提高淋巴细胞INF-γmRNA的表达水平，有利于提高蛋鸡免疫力。韦晓晨等[9]研究表明，人参多糖可以提高鸡的免疫器官指数，促进鸡血清中抗炎因子的分泌，提高机体的免疫性能。黄花蒿多糖源自黄花蒿植物，是黄花蒿中主要的生物活性大分子之一。和多数植物多糖类似，黄花蒿有抗炎、增强机体免疫力以及抗氧化等作用[10]。提取植物多糖多采用热水浸提法、超声和微波辅助法，但这些方法提取效率低、耗时长，还可能会破坏多糖结构[11]。酶解法提取条件较温和、效率高，能够降低体系中的活化能，加速多糖的释放。酶解多糖常用的酶有纤维素酶、蛋白酶及果胶酶。纤维素酶可以水解植物细胞壁释放其内容物；蛋白酶可以水解糖蛋白中游离的蛋白质，帮助多糖分子溶出；果胶酶可以降解细胞间的果胶质，更好的分离细胞[12]。酶提取法可显著提升多糖得率。试验探讨酶解处理法提取黄花蒿多糖的最佳工艺条件，为黄花蒿多糖的开发利用提供参考。1材料与方法1.1材料与试剂黄花蒿采自呼和浩特，木瓜蛋白酶（酶活性800 U/mg）、纤维素酶（酶活性50 U/mg）、果胶酶（酶活性500 U/mg）购自上海源叶生物科技有限公司，无水乙醇、无水葡萄糖、苯酚、硫酸均为分析纯，无水乙醇购自天津市北联精细化学品开发有限公司，无水葡萄糖购自天津市福晨化学试剂厂，苯酚购自上海凛恩科技发展有限公司，硫酸购自国药集团。1.2仪器设备DT-10KA电子天平（金羊砝码仪器有限公司，常熟）、HZQ-X160恒温震荡培养箱（华美生化仪器公司）、RE-5298旋转蒸发仪（亚荣生化仪器设备有限公司）、SHB-3循环水式多用真空泵（长城科工贸有限公司）、ALPHA 1-2LDplus真空冷冻干燥机（Marin Christ公司，德国）、V-1000可见光分光光度计（翱艺仪器有限公司）。1.3试验方法1.3.1黄花蒿多糖的提取准确称取10.0 g黄花蒿粉，参照帅学宏等[13]的提取方法，按1∶30料液比（g/mL）加入蒸馏水300 mL，设定酶解条件（酶浓度、酶解温度、酶解时间），在150 r/min恒温振荡培养箱中进行酶解，得到黄花蒿多糖浸提液，经90 ℃高温灭活、抽滤浓缩、Savage除蛋白、无水乙醇沉淀、冷冻干燥等一系列步骤[14]，得黄花蒿多糖。1.3.2多糖含量的测定采用苯酚-硫酸法对黄花蒿多糖的含量进行测定[15]。以葡萄糖（g/L）作为标准品测定黄花蒿多糖含量，分别取浓度为0.1 g/L的葡萄糖溶液0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL，加蒸馏水至2 mL，其浓度分别为0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10 g/L，加入6%的苯酚溶液1 mL、浓硫酸5 mL，混匀，沸水浴加热20 min，取出，流水冷却至室温，在波长490 nm处测其吸光度值。以葡萄糖浓度为横坐标，490 nm下所测吸光度值为纵坐标绘制葡萄糖标准曲线，根据标准曲线方程计算黄花蒿多糖含量。黄花蒿多糖得率（Y）计算公式如下。Y=[(A×B)/C]×100%(1)式中：A为黄花蒿多糖浓度（由回归方程求得）（g/L）；B为黄花蒿多糖溶液体积（mL）；C为黄花蒿质量（g）。1.3.3酶种类的筛选固定料液比1∶30、酶解温度50 ℃、酶解时间2 h、摇床转速150 r/min，保持以上提取条件不变，分别选取纤维素酶、木瓜蛋白酶和果胶酶，酶添加量均为1%，探讨酶种类对多糖得率的影响，同时以多糖得率为参考指标，与50 ℃热水浸提法（时间2 h、料液比1∶30）进行比较。每个处理做3次重复。1.3.4酶解反应条件的筛选采用单因素试验设计方法，即：固定料液比1∶30，酶解温度50 ℃，酶解时间2 h，考察酶的不同添加量（0.25%、0.50%、1.00%、1.50%、2.00%）对黄花蒿多糖得率的影响；固定酶解时间2 h，酶添加量1.0%，考察不同酶解温度（40、45、50、55、60 ℃）对黄花蒿多糖得率的影响；固定酶解温度50 ℃，酶添加量1.0%，考察不同酶解时间（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）对黄花蒿多糖得率的影响[15]。每个处理做3次重复。1.3.5正交试验设计由单因素试验可得酶解反应适宜条件为：酶浓度1.0%、提取时间2.5 h、提取温度45 ℃。为进一步得到最佳酶解条件，采取3因素3水平正交试验[16]，L9（33）正交试验因素水平设计见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.T001表1L9（33）正交试验因素水平设计水平A酶添加量/%B酶解温度/℃C酶解时间/h10.5402.021.0452.531.5503.01.4数据统计与分析使用Microsoft office excel 2010进行数据处理、GraphPad Prism 8绘图，使用SAS 9.2进行数据分析。2结果与分析2.1黄花蒿多糖含量测定结果以葡萄糖溶液为标准品绘制标准曲线，葡萄糖溶液标准浓度曲线见图1。其回归方程为y=13.249x-0.004 1，R2=0.997 5。根据黄花蒿多糖水溶液测定的吸光度值，由上述标准曲线回归方程计算黄花蒿多糖浓度，得黄花蒿多糖含量为53.11%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.F001图1葡萄糖溶液标准浓度曲线2.2酶种类对黄花蒿多糖得率的影响（见表2）由表2可知，经过酶处理的黄花蒿其多糖得率显著高于热水浸提法（P0.05），采用纤维素酶处理的黄花蒿其多糖得率显著高于木瓜蛋白酶和果胶酶（P0.05）。因此，后续试验将以纤维素酶为研究对象，探究其添加量、酶解温度和酶解时间对黄花蒿多糖得率的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.T002表2酶种类对黄花蒿多糖得率的影响项目木瓜蛋白酶纤维素酶果胶酶热水浸提P值多糖得率11.84±0.22B13.06±0.11A11.21±0.27C7.32±0.21D0.000 1注：同行数据肩标字母不同表示差异显著（P0.05），字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。%2.3酶添加量对黄花蒿多糖得率的影响（见图2）由图2可知，随着纤维素酶添加量的增加，黄花蒿多糖得率逐渐升高，1.0%~2.0%时，黄花蒿多糖提取效果显著高于酶添加量为0.25%及0.5%时（P0.05）。当酶添加量为1.0%时，黄花蒿得率为13.08%，继续增加纤维素酶添加量，黄花蒿多糖得率上升不显著（P0.05）。因此，纤维素酶最佳添加量为1.0%。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.F002图2酶添加量对黄花蒿多糖得率的影响注：图中数据字母相同表示差异不显著（P0.05），字母不同表示差异显著（P0.05）；下图同。2.4酶解温度对黄花蒿多糖得率的影响（见图3）由图3可知，45~55 ℃时的黄花蒿多糖得率显著高于40 ℃时（P0.05）。在45 ℃时，多糖得率达到最大值为13.42%。45 ℃后，随着酶解温度的升高，多糖得率开始下降。酶解温度到60 ℃时，黄花蒿多糖得率显著降低（P0.05）。因此，纤维素酶提取黄花蒿多糖的最适温度为45 ℃。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.F003图3酶解温度对黄花蒿多糖得率的影响2.5酶解时间对黄花蒿多糖得率的影响（见图4）如图4可知，纤维素酶解时间在1.0~2.5 h时，黄花蒿多糖的得率随着酶解时间的延长而升高。当酶解时间为2.5 h时，黄花蒿多糖得率最高且显著高于酶解时间为1.0 h及1.5 h时（P0.05）。超过2.5 h后，黄花蒿多糖得率下降。因此，纤维素酶提取黄花蒿多糖的最适酶解时间为2.5 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.F004图4酶解时间对黄花蒿多糖得率的影响2.6正交试验结果正交试验结果见表3，方差分析表见表4。由表3、表4及F检验结果表明，纤维素酶的添加量对黄花蒿多糖得率有显著影响，而酶解温度和酶解时间这两个因素作用不显著。各因素对于黄花蒿多糖得率的影响顺序为ABC，即酶添加量酶解温度酶解时间。纤维素酶提取黄花蒿多糖的最佳酶解条件为A3B2C1，即酶添加量1.5%、酶解温度45 ℃、酶解时间2 h。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.T003表3正交试验结果试验号A酶添加量B酶解温度C酶解时间多糖得率%111110.51212211.26313311.69421212.82522313.38623113.30731313.24832114.65933213.78K133.4636.5738.46K239.5039.2937.86K341.6738.7738.31R8.212.720.6010.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.019.T004表4正交试验方差分析变异来源离均差平方和自由度均方F值F0.05A酶添加量12.066 126.0326.22*19B酶解温度1.389 920.693.00C酶解时间0.065 020.031误差0.454 120.233讨论多糖作为植物中的主要活性物质之一，可以促进动物生长、提高其生产性能、避免抗生素引发环境问题[17]。为实现对植物资源的综合利用，研究人员致力于研究多糖的提取方法。传统的热水浸提法因难以完全破坏植物细胞壁而影响提取效果，造成资源浪费。利用微波辅助法可使植物细胞内压力变大从而破坏细胞壁，释放多糖，但多糖结构可能会受到破坏。魏增云等[18]采用此方法提取黄花蒿多糖，其得率达到9.72%。酶解法因其具有提取条件温和以及提取效率高的优点而受到广泛应用。帅学宏等[13]采用木瓜蛋白酶提取黄花蒿多糖，通过正交优化其多糖得率可提高到10.76%。纤维素酶具备专一地水解植物细胞壁的特质，能够使其内容物更容易被溶解，而不影响其内容物的成分结构[12,19]。本试验对比木瓜蛋白酶、纤维素酶和果胶酶3种酶解处理法对黄花蒿多糖得率的影响，发现在相同提取条件下，纤维素酶解提取黄花蒿多糖得率高于木瓜蛋白酶和果胶酶，这与周立等[20]的研究结果一致。本研究中，正交试验结果表明，当纤维素酶添加量为1.5%、酶解温度为45 ℃、酶解为2.5 h时，黄花蒿多糖得率最高，可能因为此条件下纤维素酶能够与黄花蒿充分接触，有效分解其细胞壁[21]；酶解温度为45 ℃时黄花蒿多糖得率最高，酶作为一类对温度敏感的蛋白质，超过其最适温度时，酶分子的空间结构由于能量的增加会发生改变，导致酶活性减弱或丧失，从而影响催化效果[22]；酶解2 h，酶解充分，多糖能最大限度溶出，而酶解时间过长会导致酶逐渐失活，部分多糖会被水解，黄花蒿多糖结构发生降解导致得率降低[23]。4结论试验以黄花蒿多糖得率为评价指标，通过对酶种类的筛选，确定纤维素酶为酶法提取工艺的适宜水解酶；在单因素结果基础上，采用正交法优化黄花蒿多糖的提取工艺，最终确定纤维素酶用量1.5%、酶解温度为45 ℃、酶解时间为2 h。在此条件下，黄花蒿多糖得率高达14.65%，优于传统水提法。