甘蔗是甘蔗收获后的农作副产物，产量极大[1]。甘蔗叶含有纤维素、半纤维素、木质素[2]，含有黄酮类、多酚类、多糖类等功能物质[3]。研究表明，甘蔗叶中包含11种黄酮类化合物[4]。黄酮类化合物属多酚类化合物，是甘蔗叶中抗氧化活性最强的成分[5]，具有抗氧化作用，能促进动物的生长发育[6]，提高动物的免疫功能[7]，促进乳牛泌乳[8]和提高母鸡产蛋率[9]。植物源黄酮类化合物具有改善家畜肠道黏膜形态、调节肠道菌群以及缓解热应激等功效[10]。Yuan等[11]发现，添加杜仲叶黄酮可以减轻仔猪由于敌草快引起的生长性能损伤、氧化应激、炎症反应和肠道损伤等症状。Muqier等[12]在基础饲粮中添加沙葱总黄酮，发现沙葱总黄酮可以提高肉羊抗应激能力，改善其生长性能和免疫功能。微波辅助萃取通过局部加热引起细胞急剧膨胀，使细胞壁破裂，促进细胞内成分从破裂的细胞渗出到周围的溶剂中。微波辅助萃取技术具有快速、“绿色和清洁”的性能[13-14]。研究采用响应面法优化甘蔗叶总黄酮的提取工艺，测定甘蔗叶黄酮提取液的体外抗氧化活性，旨在为甘蔗叶资源的充分利用及药用研究提供参考。1材料与方法1.1试验材料甘蔗叶采自来宾市甘蔗地，烘干粉碎，过60目筛备用；芦丁标准品（阿拉丁试剂上海有限公司）；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）（美国Sigma公司）；抗坏血酸、无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、亚硝酸钠、过氧化氢、硫酸亚铁等试剂均为分析纯（西陇科学股份有限公司）。1.2试验仪器XH-MC-1实验室微波催化合成仪（北京祥鹄科技发展有限公司）、722S型可见分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）、KQ-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）、SHZ-D（III)型循环水式多用真空泵（郑州亚荣仪器有限公司）、RE-5210A型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂)。1.3试验方法1.3.1甘蔗叶总黄酮的提取准确称取甘蔗叶粉末1.000 0 g，加入乙醇溶液，密封浸泡30 min，在不同微波时间、微波温度和微波功率下微波萃取，抽滤，滤液加入乙醇溶液定容至50 mL，得甘蔗叶总黄酮提取液。1.3.2甘蔗叶总黄酮提取量的测定绘制芦丁标准曲线，得标准曲线的线性回归方程：y=10.235x+0.009 16（R2=0.999 39）。移取甘蔗叶总黄酮提取液2 mL于10 mL比色管，按Ma等[15]试验方法测定甘蔗叶总黄酮提取量，将测得的吸光值代入芦丁标准曲线方程，求样品相应的质量浓度，计算甘蔗叶的总黄酮提取量。甘蔗叶总黄酮提取量(mg/g)=CV0V1mV2 (1)式中：C为标准曲线中计算提取液的质量浓度（g/L）；V0为提取液加入试剂显色定容之后的体积（mL）；V1为定容后甘蔗叶总黄酮提取液的体积（mL）；V2为用于测定而移取提取液的体积（mL）；m为甘蔗叶粉的质量（g）。1.3.3单因素试验设计准确称取甘蔗叶粉末1.000 0 g。其他条件保持一致，分别考察液料比（20、25、30、35、40、45 mL/g）、乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%、80%）、微波时间（2、3、4、5、6、7 min），微波功率（200、300、400、500、600、700 W），微波温度（40、50、60、70、80、90 ℃）5个因素对甘蔗叶总黄酮提取量的影响。1.3.4响应面优化试验设计基于单因素试验，选取乙醇浓度、微波功率、微波温度为自变量，以甘蔗叶总黄酮提取量为响应值，采用Design-Expert 8.0.6软件进行响应面试验，确定甘蔗叶总黄酮的最佳提取工艺条件，并进行验证试验。响应面因素与水平编码见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.T001表1响应面因素与水平编码编码A乙醇浓度/%B微波功率/WC微波温度/℃-1403005005040060160500701.3.5抗氧化试验将最优工艺条件提取得到甘蔗叶总黄酮提取液进行蒸发浓缩，采用乙醇将浓缩液梯度稀释为50、100、150、200、250、300、350、400、450、500 mg/L待测液，采用分光光度法分别在517、510 nm波长处进行DPPH自由基清除率测定[16]和羟基自由基清除率测定[17]。以VC为阳性对照。DPPH自由基清除率=(1-A1-A2A0)×100% (2)式中：A1为2 mL甘蔗叶总黄酮待测液+2 mL DPPH无水乙醇溶液的吸光度；A2为2 mL无水乙醇＋2 mL甘蔗叶总黄酮提取液的吸光度；A0为2 mL无水乙醇＋2 mL DPPH无水乙醇溶液的吸光度。羟基自由基清除率=(1-A1-A2A0)×100% (3)式中：A1为2 mL甘蔗叶总黄酮待测液＋2 mL FeSO4溶液＋2 mL H2O2溶液＋2 mL水杨酸溶液的吸光度；A2为2 mL甘蔗叶总黄酮待测液＋2 mL FeSO4溶液＋2 mL蒸馏水＋2 mL水杨酸溶液的吸光度；A0为2 mL蒸馏水＋2 mL FeSO4溶液＋2 mL H2O2溶液＋2 mL水杨酸溶液的吸光度。自由基清除率越大，抗氧化活性就越强，反之抗氧化活性越弱[18]。1.3.6数据统计与分析每组试验至少进行3组平行试验，数据结果以“平均值±标准差”表示。用响应面软件和Origin 9.0进行数据分析。2结果与分析2.1单因素试验及其分析2.1.1液料比对甘蔗叶总黄酮提取量的影响（见图1）由图1可知，液料比20~40 mL/g时，甘蔗叶总黄酮提取量与液料比呈正相关。液料比40 mL/g时，甘蔗叶的总黄酮提取量达到最大值8.569 mg/g。可能的原因是随着乙醇量的增大，乙醇溶液与甘蔗叶粉末的接触更加充分，甘蔗叶中总黄酮的溶解更多。液料比超过40 mL/g时，甘蔗叶总黄酮提取量开始下降，因为在液料比为40 mL/g时，甘蔗叶中的黄酮已充分溶出，继续增大溶剂体积会减少物料对微波能量的吸收，加大甘蔗叶中其他组分的溶出，导致甘蔗叶总黄酮提取量降低[17,19]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F001图1液料比对甘蔗叶总黄酮提取量的影响2.1.2乙醇浓度对甘蔗叶总黄酮提取量的影响（见图2）由图2可知，随着乙醇浓度的增大，甘蔗叶总黄酮提取量先升高再降低，当乙醇浓度为50%时，总黄酮提取量达到最大值为9.122 mg/g。可能的原因是乙醇浓度影响溶剂的极性，从而影响总黄酮的提取量。乙醇浓度越大，溶剂极性则越大，越有利于总黄酮的提取；但当乙醇浓度过大时，醇溶性杂质溶出也越多，出现溶出竞争现象，导致甘蔗叶总黄酮的提取量下降[20]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F002图2乙醇浓度对甘蔗叶总黄酮提取量的影响2.1.3微波时间对甘蔗叶总黄酮提取量的影响（见图3）由图3可知，随着反应时间的增长，总黄酮提取量先升高再降低。2~4 min的甘蔗叶总黄酮提取量呈现上升的趋势，在4 min时，黄酮提取量最大为9.725 mg/g。4 min时，甘蔗叶中的总黄酮溶出最充分，提取最完全。随着微波时间的继续延长，总黄酮提取量降低，可能因为反应时间过长，持续产生热量越大，使黄酮中的一些热敏性物质结构被破坏，影响总黄酮的提取量[21]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F003图3微波时间对甘蔗叶总黄酮提取量的影响2.1.4微波功率对甘蔗叶总黄酮提取量的影响（见图4）由图4可知，随着微波功率的增大，甘蔗叶总黄酮提取量先升高再降低。微波功率在小于400 W时，甘蔗叶的总黄酮提取量随功率的加大而逐渐变大，这可能因为巨大的内部压力和分子之间产生的摩擦力让甘蔗叶细胞的破碎程度变高[21]，溶剂大量进入甘蔗叶细胞内充分接触，利于甘蔗叶总黄酮溶解。当微波功率超过400 W，总黄酮提取量反而下降。可能的原因是，功率过大，溶剂温度过高，乙醇溶剂挥发造成溶剂损失，且甘蔗叶黄酮类化合物遭到破坏[17]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F004图4微波功率对甘蔗叶总黄酮提取量的影响2.1.5微波温度对甘蔗叶总黄酮提取量的影响（见图5）由图5可知，随着微波温度升高，甘蔗叶总黄酮提取量先升高再降低。60℃时，甘蔗叶总黄酮提取量最大。这可能因为温度升高，甘蔗叶总黄酮溶解度增大使提取量增大，但温度过高导致乙醇挥发，减少与甘蔗叶粉末接触的溶剂量，高温还会使黄酮类物质降解的速度加快，破坏甘蔗叶中黄酮类物质的挥发性成分、热不稳定性成分且发生氧化，导致甘蔗叶总黄酮提取量变少[22]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F005图5微波温度对甘蔗叶总黄酮提取量的影响2.2响应面结果分析2.2.1响应面试验结果与分析以甘蔗叶总黄酮提取量为响应值，按照表1的因素水平表进行响应面试验，试验结果见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.T002表2响应面试验方案及结果试验编号A乙醇浓度B微波功率C微波温度总黄酮提取量/(mg/g)100010.645200010.620300010.694400010.7185-1-109.179610-19.66870119.79080-1-19.25390-119.130101-109.22811-10-19.5211201-19.375131019.49714-10110.0341500010.694161109.13017-1109.692用Design-Expert 8.0.6软件处理表2中的试验数据，得到二次多项回归方程为：Y=10.67－0.11A＋0.15B＋0.079C－0.15AB-0.17AC＋0.13BC－0.54A2－0.83B2－0.46C2方差分析与显著性检验见表3。由表3可知，模型P0.000 1（极显著），模型失拟项P=0.110 40.05（不显著）。模型相关系数R2=0.995 9，R2adj=0.990 5，说明该模型能解释99.05%的响应值，所得模型拟合度良好，可以用该模型预测实际的甘蔗叶黄酮的提取率。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.T003表3方差分析与显著性检验方差来源平方和自由度均方F值P值显著性模型6.14090.680187.100.000 1**A0.10010.10027.940.001 1**B0.18010.18049.100.000 2**C0.05010.05013.780.007 5**AB0.09310.09325.590.001 5**AC0.12010.12032.070.000 8**BC0.07210.07219.840.003 0**A21.21011.210332.850.000 1**B22.90012.900795.190.000 1**C20.88010.880241.320.000 1**残差0.02673.648×10-3失拟项0.01936.347×10-33.910.110 4纯误差6.493×10-341.623×10-3总和6.17016相关系数R20.995 9调整复相关系数R20.990 5变异系数C.V.%0.620 0注：*表示影响显著（P＜0.05），**表示影响极显著（P＜0.01）。通过方差分析确定因素对显著性，F值越大，P值越小，表明影响越显著[23]。表3模型中，一次项、二次项以及交互项对响应值的影响均极显著，三个响应变量对甘蔗叶总黄酮提取量影响的强弱顺序为：B（微波功率）A（乙醇浓度）C（微波温度）。2.2.2各因素交互作用对甘蔗叶总黄酮提取量的影响Design-Expert软件分析乙醇浓度、微波功率、微波温度3个因素对甘蔗叶总黄酮提取量的交互影响的响应面分析见图6~图8。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F006图6乙醇浓度与微波功率对总黄酮提取量的响应面分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F007图7乙醇浓度和微波温度对总黄酮提取量的响应面分析10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F008图8微波功率和微波温度对总黄酮提取量的响应面分析通过观察二维等高线图及三维响应面图的形状、陡峭幅度可以判断各因素之间交互作用的强弱程度[24]。由图6可知，等高线为椭圆形，响应面曲线坡度陡峭，且微波功率B的曲面比乙醇浓度A的曲面要陡峭，表明微波功率B对甘蔗叶总黄酮提取量的影响较乙醇浓度A显著，表明乙醇浓度与微波功率的交互作用极显著。由图7可知，甘蔗叶总黄酮提取量随乙醇浓度和微波温度的增大呈现先上升再下降的趋势，响应面陡峭，且等高线近似椭圆，表明两者交互作用极显著，与方差分析结果一致。由图8可知，微波功率的曲线陡峭程度比微波温度大，表明微波功率对甘蔗叶总黄酮提取量的影响较微波温度的大。此外，该等高线图为椭圆形因此可判断微波功率B和微波度C之间有极其显著的交互作用。2.2.3最佳工艺方案的确定及验证经Design-Expert 8.0.6分析得到甘蔗叶总黄酮的最佳提取工艺为：液料比40 mL/g、乙醇浓度48.58%、微波时间4 min、微波功率411.38 W、微波温度61.29 ℃，此时总黄酮提取量为10.696 mg/g。考虑实际操作情况将最优提取参数调整为：液料比40 mL/g、乙醇浓度49%、微波时间4 min、微波功率400 W、微波温度61℃。按此工艺条件进行3次平行试验，得到平均总黄酮提取量为10.628 mg/g，与模型预测值相差较小为0.14%，说明该模型试验可重复性好，可信度高，能较好预测甘蔗叶总黄酮提取量。2.3抗氧化试验甘蔗叶总黄酮对DPPH自由基和羟自由基的清除能力见图9、图10。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F009图9甘蔗叶总黄酮对DPPH自由基的清除能力10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.021.F010图10甘蔗叶总黄酮对羟自由基的清除能力由图9、图10可知，在50~500 mg/L的浓度范围内，随着浓度的逐渐增大，甘蔗叶总黄酮和VC对DPPH自由基和羟基自由基的清除率也逐渐增强，两者均具有良好的量效关系。在浓度为500 mg/L时，甘蔗叶总黄酮对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为87.21%和88.69%，VC对DPPH自由基和羟自由基的清除率分别为96.03%和96.78%，这表明在相同浓度下，甘蔗叶总黄酮对DPPH自由基和羟自由基均具有较好的清除作用，但清除效果略低于阳性对照VC。3结论试验采用微波辅助乙醇浸提法对甘蔗叶中总黄酮进行提取，通过单因素和响应面试验，确定甘蔗叶提取总黄酮的最佳工艺条件为；液料比40 mL/g、乙醇浓度49%、微波时间4 min、微波功率400 W、微波温度61 ℃。此条件下，甘蔗叶总黄酮提取量为10.628 mg/g，与模型预测值10.696 mg/g相近。体外抗氧化试验结果显示，甘蔗叶总黄酮提取液对DPPH自由基和羟自由基均具有较高的清除率，表现出较强的抗氧化能力。