微生态制剂功效全面、安全环保，是替代饲用抗生素的首选[1]。乳酸菌和芽孢杆菌微生物制剂因其生物特性难以兼备优良生产性能和高度抗逆性。凝结芽孢杆菌作为可以形成芽孢的乳酸菌，秉承了乳酸菌的生产性能优势且具有高度耐受性[2-4]。凝结芽孢杆菌是一种兼性厌氧生存、可形成芽孢、能够产生乳酸的革兰氏阳性菌，其在制剂中以内生孢子形式存在，其芽孢体具有耐酸、耐热和耐胆盐等特点[5]。作为一类新型的益生菌饲料添加剂，凝结芽孢杆菌可以平衡肠道菌群，提高机体免疫力、饲料利用率和动物生产性能[6-8]。Adami等[9]发现，添加凝结芽孢杆菌使得猪肠道大肠杆菌群数量减少，说明凝结芽孢杆菌对肠道菌群起正向调节作用。赵娜等[10]在饲粮中添加凝结芽孢杆菌，发现凝结芽孢杆菌可以抑制肉鸡肠道中大肠杆菌的生长，提高免疫器官指数，降低死淘率。汪攀等[11]发现，凝结芽孢杆菌NJ102能改善肉鸡的生长性能。现代工业中经常使用的干燥法（冷冻干燥和喷雾干燥）将益生菌制成粉剂产品，喷雾干燥因其经济有效的特点在益生菌制品中广泛使用[12-14]。研究对凝结芽孢杆菌NJh032发酵液进行喷雾干燥，并对其粉制剂进行体外耐受性试验，通过体外试验对其益生性能进行分析，为凝结芽孢杆菌微生物制剂的开发提供一些参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1菌种凝结芽孢杆菌NJh305由实验室分离保存。抑菌指示菌：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC29213、大肠杆菌（Escherichia coli）ATCC25922、大肠杆菌菌株K88（E. coli) C83901均购自中国兽医药品监察所。1.1.2材料与试剂MRS培养基、LB肉汤、芽孢杆菌生化鉴定条、哥伦比亚血平板均购自广东环凯微生物科技有限公司。种子培养基：MRS肉汤。发酵培养基：葡萄糖15 g/L、蛋白胨10 g/L、玉米粉5 g/L、豆粕粉4.5 g/L、酵母浸膏1 g/L、碳酸钙1.5 g/L、无水MgSO4 0.45 g/L、MnSO4·H2O 0.3 g/L、K2HPO4·3H2O 1 g/L。可溶性淀粉平板：TSA培养基中加可溶性淀粉，使淀粉浓度为2.5%，121 ℃灭菌15 min倒平板备用。干酪素平板：TSA培养基加1%干酪素，121 ℃灭菌15 min倒平板备用。脱脂牛奶平板：TSA培养基和脱脂奶粉分开灭菌，TSA培养基121 ℃灭菌15 min，5%脱脂牛奶108 ℃灭菌15 min，最后混合倒平板备用，使得脱脂牛奶终浓度为2.5%。三丁酸甘油酯平板：TSA培养基加1%三丁酸甘油酯乳化液，121 ℃灭菌15 min倒平板备用。橄榄油平板：TSA培养基加1%橄榄油乳化液，121 ℃灭菌15 min倒平板备用。CMC-Na琼脂平板：羧甲基纤维素钠1%、细菌学蛋白胨0.5%、酵母膏0.05%、KH2PO4 0.15%、MgSO4 0.02%、NaCl 0.5%、琼脂粉1.8%，121 ℃灭菌15 min倒平板备用。卢戈氏碘液：称取6 g碘化钾，溶于20 mL蒸馏水中，搅拌溶解，加4 g碘，充分溶解，加80 mL蒸馏水，贮存在棕色试剂瓶内。0.2%刚果红溶液：称取刚果红固体0.5 g，适量蒸馏水溶解，定容至250 mL。1 mol/L NaCl溶液：称取NaCl固体14.625 g，溶于150 mL蒸馏水中，定容至250 mL。模拟胃液（g/L）：胰蛋白胨8.3 g/L、葡萄糖3.5 g/L、NaCl 2.05 g/L、CaCl2 0.11 g/L、KCl 0.37 g/L、KH2PO4 0.6 g/L、猪胆盐0.05 g/L、溶菌酶0.1 g/L、胃蛋白酶13.3 g/L，用盐酸调节pH值至2.5。1.1.3仪器与设备恒温培养箱（DNP-9052，上海精宏实验设备有限公司）、高压灭菌锅（YXQ-LS-100S，上海博讯实业有限公司医疗设备厂）、厌氧袋（C-11，日本三菱公司）、显微镜（CX-23，日本奥林巴斯）、电子天平（ME204E，梅特勒-托利多仪器有限公司）、超净工作台（SW-CJ-ID，苏州净化设备有限公司）、5 L双联发酵罐（迪必尔生物工程上海有限公司）、喷雾干燥器（YC-018，上海雅程仪器设备有限公司）、管式离心机（上海浦东天本离心机械有限公司）。1.2试验方法1.2.1生理生化鉴定依据《伯杰氏细菌鉴定手册》对菌株进行生化指标测定。将纯化保种的菌种采用平板划线法接种于LB固体培养基，37 °C恒温过夜培养，挑取单菌落接种至生化鉴定条（相关试剂购自广州环凯微生物科技有限公司）。若试剂条中内容物为液体，采用菌悬液法接种；若内容物为固态，则采用“之”字形划线接种或穿刺接种。1.2.2产酶能力研究点种法：将灭菌后的牙签挑取活化后的单菌落，接种至6种产酶平板上，每个平板等距接种3次，37 ℃恒温好氧培养24~48 h。培养24 h后，观察平板上是否出现透明水解圈，干酪素、牛奶、三丁酸甘油酯和橄榄油平板直接观察，淀粉平板需要使用卢戈氏碘液染色后观察，CMC-Na平板需要使用刚果红染色后观察。刚果红染色方法：在CMC-Na平板中加入2 mL 0.2%刚果红溶液，转动平板，让溶液均匀分布至整个平板的表面，静置，显色30 min，倒出显色液，加入3 mL氯化钠洗脱液，轻旋至均匀覆盖平板表面，洗脱处理15 min，观察透明水解圈情况。1.2.3体外抑菌活性研究无菌工作台取2 mL指示菌液，分光光度计测其OD值的大小，稀释调整OD值为0.145。采用棉签蘸取稀释后的有害菌涂布于LB平板上。使用镊子夹取牛津杯放置涂好的平板上，3个牛津杯等距放置三角架上，移液器取200 µL凝结芽孢杆菌种子液于牛津杯，（用无菌MRS液体培养基做阴性对照），37 ℃过夜培养24 h，采用游标卡尺测量抑菌圈直径。1.2.4发酵罐培养将保存的菌株划线接种到MRS培养基斜面，37 ℃厌氧培养24 h。挑取活化后的菌落接种到MRS液体培养基，37 ℃，200 r/min培养24 h。以培养24 h的菌液作为种子液接种到发酵培养基，接种量为5%，5 L发酵罐37 ℃发酵24 h。1.2.5发酵液离心和喷雾干燥收集发酵液于管式离心机离心，收集菌体进行喷雾干燥，进风温度160 ℃，出风温度80 ℃。1.2.6耐高温、模拟耐胃酸和耐胆盐试验以活菌数为测定指标，温度、pH值2.5、胆盐为因素进行单因素试验[15]。模拟体内消化环境，探究该粉剂的实用性。耐高温试验：取1 g粉剂于99 mL无菌生理盐水稀释，制得10-2 g/mL菌悬液4瓶，分别在80、90、100 ℃处理10 min，其中1瓶做对照，进行MRS平板涂布计数，37 ℃厌氧培养48 h，统计结果。耐酸和耐胆盐试验：取1 g粉剂于灭菌的MRS液体培养基，制得10-2菌悬液3瓶，其中1瓶用稀盐酸调pH值至2.5处理2 h，一瓶用0.3%胆盐处理2 h，一瓶做对照，分别进行MRS平板涂布计数，37 ℃厌氧培养48 h，统计结果。活菌数测定：吸取处理后的凝结芽孢杆菌培养液10 mL放于装有90 mL无菌水的离心管中，混合均匀，取500 µL刚混合的菌液加入另一个装有4 500 μL无菌水的离心管中，重复操作，稀释到合适倍数，选择两个梯度涂布进行活菌计数，每个梯度重复3次。1.2.7药敏及溶血性试验将活化后的产品培养液用新鲜MRS培养基稀释至OD600值在0.145~0.150之间，再用无菌棉签均匀地将菌液涂布在20 mL LB平板上，然后在其上等距贴上3个药物敏感测试滤纸片，37 ℃培养24 h，观察平板上药物的抗菌活性，记录各抗生素的抑菌圈直径大小。试验重复3次，取平均值，按照抑菌圈直径标准进行菌株的药敏性评定[16]。挑取单菌落划线于血平板，37 ℃培养24 h，观察是否出现溶血透明圈。1.3数据统计与分析数据采用Microsoft Excel 2010进行统计学分析，数据结果以“平均值±标准差”表示。2结果与分析2.1分离菌株形态（见图1）由图1（a）可知，分离得到的单菌落呈圆形，乳白色不透明，凸起边缘整齐，有轻微光泽，周围出现透明圈如图。由图1（b）可知，菌株染色鉴定为革兰氏阳性菌，细胞呈杆状且可形成端生椭圆形芽孢，芽孢囊不明显膨大。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.F001图1分离菌株形态(a) MRS琼脂平板菌落 （b） 平板菌落100倍油镜镜检2.2分离菌株生理生化鉴定（见表1）由表1可知，初步鉴定分离菌株为芽孢杆菌属细菌。结合其菌落菌体特征，将该菌株进一步鉴定为凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans），并命名为凝结芽孢杆菌NJh032，保存于本实验室。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T001表1分离菌株生理生化鉴定项目结果接触酶+运动性检验+明胶液化+卵磷脂酶-D-木糖+L-阿拉伯糖+D-甘露醇+葡萄糖+7%NaCl+55 ℃生长+pH值5.7+V-P试验+淀粉水解+柠檬酸盐+丙酸盐-硝酸盐还原+甲基红+注：“+”表示生化反应为阳性，“-”表示生化反应为阴性。2.3凝结芽孢杆菌NJh032产酶分析（见表2）由表2可知，凝结芽孢杆菌NJh032可分别在可溶性淀粉培养基以及干酪素和牛奶平板上生长并产生水解圈，显示凝结芽孢杆菌NJh032可以产淀粉酶和蛋白酶。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T002表2凝结芽孢杆菌NJh032产酶分析培养基（产生酶的种类）是否水解透明圈圈菌比干酪素（蛋白酶）+4.35±0.21脱脂牛奶（蛋白酶）+3.63±0.18可溶性淀粉（淀粉酶）+2.58±0.11三丁酸甘油酯（脂肪酶）-/橄榄油（脂肪酶）-/羧甲基纤维素钠（纤维素酶）-/2.4凝结芽孢杆菌NJh032对3种致病菌的抑菌效果（见表3）由表3可知，凝结芽孢杆菌NJh032对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌k88及大肠杆菌25922均有抑制效果，产生的抑菌圈均大于15 mm，表明凝结芽孢杆菌NJh032发酵液中产生的物质能显著地抑制这3种致病菌的生长。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T003表3凝结芽孢杆菌NJh032对3种致病菌的抑菌效果指示菌株抑菌圈直径/mm金黄色葡萄球菌2921317.23±0.21大肠杆菌2592215.84±0.14大肠杆菌K8816.34±0.202.5凝结芽孢杆菌NJh032粉剂体外耐高温、耐酸耐胆盐分析凝结芽孢杆菌NJh032粉剂在不同温度下的存活情况见表4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T004表4凝结芽孢杆菌NJh032粉剂在不同温度下的存活情况处理活菌数/（×108 CFU/g）存活率/%对照38.10±0.12100.0080 ℃处理37.80±0.1699.2190 ℃处理35.50±0.1193.18100 ℃处理24.90±0.1665.35由表4可知，凝结芽孢杆菌NJh032粉剂可耐受80 ℃处理10 min；90 ℃处理10 min后存活率高达93.18%；100 ℃处理10 min后存活率为65.35%。凝结芽孢杆菌NJh032粉剂在模拟胃液处理后的存活情况见表5。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T005表5凝结芽孢杆菌NJh032粉剂在模拟胃液处理后的存活情况处理活菌数/（×108 CFU/g）存活率/%对照37.80±0.21100.00模拟胃液18.50±0.1448.94由表5可知，凝结芽孢杆菌NJh032粉剂pH值2.5处理2 h存活率为48.94%。凝结芽孢杆菌NJh032粉剂在胆盐的处理后的存活情况见表6。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T006表6凝结芽孢杆菌NJh032粉剂在胆盐的处理后的存活情况处理活菌数/（×108 CFU/g）存活率对照38.50±0.20100.000.3%胆盐37.60±0.2197.66由表6可知，凝结芽孢杆菌NJh032可耐受0.3%胆盐2 h，0.3%胆盐处理后存活率高达97.66%。2.6凝结芽孢杆菌NJh032的药敏性和副溶血症试验（见表7）由表7可知，该产品对复方新诺明和诺氟沙星两种抗菌药物具有耐药性，对其他8种药物均呈现药物敏感性，建议避免同时使用。凝结芽孢杆菌NJh032在血平板上未出现溶血透明圈，表明该菌株无溶血性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.023.T007表7凝结芽孢杆菌NJh032的药敏性和副溶血症试验编号抗生素纸片含量抑菌圈直径/mm敏感性1庆大霉素10 μg/片40.87±0.21S2氯霉素30 μg/片34.26±0.12S3复方新诺明23.75/1.25 μg/片4.18±0.16R4环丙沙星5 μg/片38.55±0.20S5诺氟沙星10 μg/片12.60±0.11R6红霉素15 μg/片26.34±0.20S7丁胺卡那30 μg/片42.18±0.15S8头孢唑林30 μg/片60.12±0.36S9氨苄西林10 μg/片32.35±0.21S10青霉素10 U/片52.64±0.52S3讨论本研究从猪场分离出一株产乳酸的芽孢杆菌。该菌株经鉴定为凝结芽孢杆菌，命名为凝结芽孢杆菌NJh032。试验评估该菌发酵制成粉剂的体外耐受性及药敏性以探究其产品化益生效果，将凝结芽孢杆菌发酵液通过喷雾干燥制成粉剂以探究该粉剂的体外耐受性。喷雾干燥法是一种经济有效的制备益生菌菌粉方法[17-18]。本研究的粉制剂活菌数达到38亿/g，通过试验证明，该粉制剂芽孢具有较强的环境耐受性。食物通过胃的排空时间一般为2 h，而动物胃液pH值为2.0~3.0[15]。本试验测定凝结芽孢杆菌菌株在2 h内对人工模拟胃液和胆盐的耐受性，发现该粉剂在胃肠道环境中的有良好适应性，能够耐受0.3％的胆盐。Hyronimus等[19]发现，凝结芽孢杆菌菌株对胆汁浓度的耐受性超过0.3％，与本试验结果相似。菌株NJh032对庆大霉素等8种常用抗生素均敏感，且能显著抑制金黄色葡萄球菌（S. aureus）ATCC 29213、大肠杆菌（E. coli）ATCC 25922和大肠杆菌（E. coli）K88等3种病原菌的生长，并且无溶血性，说明该菌株具有作为益生菌的安全性。4结论凝结芽孢杆菌NJh032具有较强的产淀粉酶和蛋白酶能力，能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生长，其发酵粉剂有较强的耐温性能、耐模拟胃液性能、耐胆盐性能，无溶血活性，对庆大霉素等8种常用抗生素均敏感，适应工业生产需求。