随着人们生活品质提高，人们对肉的质量要求越来越高，改善肉品质成为畜牧行业的主要探索方向之一。动物在应激过程中会产生大量活性氧物质（ROS），过量ROS会损害蛋白质、脂质和DNA[1]，引起氧化系统和抗氧化系统的失衡。这两个系统不平衡会导致酶失活、脂质过氧化等一系列氧化损伤[2]。组织和细胞中的丙二醛（MDA）含量可以反映氧化损伤的程度[3-4]。生物体在氧化损伤后，生物抗氧化酶系统中的抗氧化酶（CAT、SOD和GPX）可以清除过量的ROS，保护机体免受损伤[5]。因此，降低氧化损伤、增强机体抗氧化能力对提高肉质是至关重要的。白藜芦醇是一种来自植物的天然多酚，具有抗炎、抗氧化和平衡生物机体抗氧化系统等作用[6-8]。白藜芦醇可以提高畜禽肌肉抗氧化能力[9]。Cheng等[10]研究发现，白藜芦醇可以改善生长猪骨骼肌的抗氧化状态。Meng等[11]研究发现，白藜芦醇可以改善母猪和仔猪血液中的抗氧化状态。因此，在日粮中添加白藜芦醇可以有效改善生长猪骨骼肌的抗氧化状态。在众多畜禽抗氧化能力研究中，白藜芦醇多用于研究小鼠抗氧化作用机制，在育肥猪肉质上相关文章所验证的仅是表观酶活值，白藜芦醇在肌肉中影响内源抗氧化能力的精确分子机制和信号途径尚不清楚。因此，文章论证在生长猪日粮中添加白藜芦醇可以通过Nrf2-Keap1信号通路改善生长猪肌肉组织的抗氧化状态，为增强生长猪肌肉的抗氧化能力提供参考。1材料与方法1.1试验设计与样本采集选择24头体重约35 kg的公猪，分为4组，每组6个重复，每个重复1头猪。对照组生长猪饲喂基础日粮，试验组分别在基础日粮中添加200、400、600 mg/kg的白藜芦醇。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.005.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.000玉米73.815消化能/(MJ/kg)13.29麸皮3.550粗蛋白质/%15.00豆粕（43%）13.550粗纤维/%7.00葵花籽仁粕2.000粗灰分/%10.00豌豆3.000钙/%0.91石粉0.940总磷/%0.35碳酸氢钙0.700氯化钠/%0.35蛋氨酸羟基类似物0.145赖氨酸/%0.58氯化胆碱（液体）0.060预混料2.240注：预混料购自南宁扬翔股份有限公司。所有猪在猪舍适应1周后开始试验，初重35 kg，试验期35 d。试验结束后，采集生长猪背最长肌组织，放入冻存管，于液氮罐中储存，用于后续试验。1.2测定指标及方法1.2.1抗氧化酶活测定取0.1~0.2 g生长猪肌肉样品，研磨成肉糜置于1.5 mL EP管中，加入1 mL生理盐水，3 000 r/min离心10 min，取上清测定酶活。利用南京建城生物工程研究所试剂盒测定肌肉组织超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活性和丙二醛（MDA）含量。1.2.2荧光定量PCR以cDNA为模板进行荧光定量PCR反应，反应体系为TB Green TM Premix Ex Taq ™II 5 μL、上游引物0.25 μL、下游引物0.25 μL、cDNA 2.5 μL、RNase Free H2O 2 μL。反应程序为95 ℃预变性30 s、95 ℃变性5 s、60 ℃延伸30 s，45个循环，65 ℃延伸5 s、95 ℃延伸5 min。依据2－△△Ct方法计算每个基因在不同处理组中的mRNA表达情况。Nrf2、CAT基因引物序列参照Meng等[11]的设计。Keap1、SOD、GPX和18S rRNA自行设计交由深圳华大基因股份有限公司合成。荧光定量PCR引物序列见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.005.T002表2荧光定量PCR引物序列基因引物序列（5'-3'）产物长度/bpNrf2F：GAAAGCCCAGTCTTCATTGC190R：TTGGAACCGTGCTAGTCTCAKeap1F：TGCACGCTGCGATGGAG172R：GGGGTTCCAGATGACAAGGGSODF：GAGACCTGGGCAATGTGACT101R：CCAAACGACTTCCAGCATTTGPXF：AGCCCAACTTCATGCTCTTC159R：CATTGCGACACACTGGAGACCATF：ACGCCTGTGTGAGAACATTG124R：GTCCAGAAGAGCCTGAATGC18S rRNAF：CCCACGGAATCGAGAAAGAG122R：TTGACGGAAGGGCACCA1.2.3Western blot冷冻组织利用0.5 mL裂解液/100 mg组织匀浆，加入含有PMSF（Solarbio，中国）的裂解液缓冲液，提取总蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒（beyotime biotechnology，中国）测定提取的蛋白质样品浓度。取适量蛋白提取液与4×负载缓冲液混合。最终工作液为1×，在95~100 ℃恒温水浴中变性10 min，完全冷却，-20 ℃保存。将蛋白质样品（每个泳道25 g）加入凝胶（15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳）通道中，将蛋白转移到PVDF膜（中国Solarbio）。浓缩凝胶的电泳参数为恒压80 V，样品进入分离凝胶时，将电泳调整到100 V，在室温下将膜密封在含有5%脱脂奶粉的TBST（becton dickinson and company，BD）中1~2 h。TBST清洗膜5次，将稀释后的Nrf2（abclonal，中国）、GAPDH（abclonal，中国）倒入孵育盒，4 ℃过夜。TBST清洗膜5次，每次5 min。加入1∶2 000稀释二级抗体（abclonal，中国），室温孵育1 h，TBST清洗5次，每次5 min，采用eECL Western blot Kit（cwbio，中国）显示印迹信号，图像J分析结果。目的基因的蛋白质测量值标准化为GAPDH。1.3数据统计与分析使用IBM SPSS Statistics 20软件中单因素方差进行统计分析，并通过LSD进行显著性分析。使用ImageJ 1.52软件分析进行蛋白图，利用Graphpad软件作图。结果以“平均值±标准差”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1白藜芦醇对生长猪肌肉组织抗氧化酶活和MDA含量的影响（见表3）由表3可知，400、600 mg/kg组生长猪肌肉MDA含量显著低于200 mg/kg组和对照组（P0.05）。与对照组相比，400、600 mg/kg组生长猪肌肉SOD和GSH-Px活性显著升高（P0.05）。600 mg/kg组生长猪肌肉CAT活性显著高于其他各组（P0.05）。结果表明，白藜芦醇可以增强生长猪肌肉组织中SOD和CAT活性，降低MDA含量。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.005.T003表3白藜芦醇对生长猪肌肉组织抗氧化酶活和MDA含量的影响组别MDA/(mol/g prot)CAT/(U/mg prot)GSH-Px/(U/mg prot)SOD/(U/mg prot)对照组1.63±0.19a49.35±7.64b63.33±4.70b20.09±4.80b200 mg/kg组0.99±0.25b59.33±1.62b67.42±3.39ab17.93±5.37ab400 mg/kg组0.48±0.12c59.04±2.47b74.72±3.52a30.84±2.31a600 mg/kg组0.42±0.13c69.29±3.11a80.22±5.78a26.31±4.03a注：同列数据肩标不同字母表示差异显著（P0.05），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。2.2白藜芦醇对生长猪相关抗氧化酶活基因表达的影响（见表4）由表4可知，与对照组相比，试验组生长猪肌肉中SOD基因表达水平显著升高（P0.05）。与对照组相比，400、600 mg/kg组生长猪肌肉中CAT的基因表达水平显著升高（P0.05）。结果表明，白藜芦醇可以提高生长猪背最长肌SOD和CAT抗氧化酶活基因的表达。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.005.T004表4白藜芦醇对生长猪相关抗氧化酶活基因表达的影响组别GSH-Px mRNASOD mRNACAT mRNA对照组1.02±0.20c1.00±0.04b1.05±0.31b200 mg/kg组2.04±0.14b1.45±0.75a1.60±0.11b400 mg/kg组3.11±0.40a1.75±0.07a2.06±0.09a600 mg/kg组3.50±0.33a1.85±0.07a2.10±0.20a2.3白藜芦醇对肌肉组织中的激活Nrf2通路的影响和Nrf2蛋白表达（见表5、图1）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.005.T005表5白藜芦醇对肌肉组织中的Nrf2通路的影响组别Keap1 mRNANrf2 mRNANrf2/GAPDH对照组1.00±0.27a1.07±0.26b1.00±0.45b200 mg/kg组0.84±0.20a1.34±0.10b1.46±0.24a400 mg/kg组0.42±0.12b1.97±0.46a1.56±0.22a600 mg/kg组0.40±0.10b2.07±0.72a1.77±0.38a由表3可知，与对照组和200 mg/kg组相比，600 mg/kg组生长猪肌肉中Nrf2的基因表达水平显著升高（P0.05），keap1基因表达水平显著降低（P0.05）。与对照组相比，200、600 mg/kg组生长猪肌肉中Nrf2蛋白表达水平显著上升（P0.05）。由图1可知，Nrf2为核因子E2相关因子2；Keap1类似于Kelch的ECH相关蛋白1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.12.005.F001图1Nrf2蛋白表达3讨论3.1白藜芦醇对生长猪背最长肌的抗氧化酶活的影响本试验测定生长猪背最长肌相关的抗氧化酶活活性以及Nrf2抗氧化通路相关基因和蛋白表达量测定，发现白藜芦醇可以提高抗氧化酶活的表达，显著影响Nrf2抗氧化通路相关基因和蛋白的表达。动物机体氧化机制和抗氧化机制之间的不平衡会导致氧化应激[12-13]。氧化应激后机体通过清除过量的ROS维持平衡，保护机体免受损伤[5]。白藜芦醇可以抑制活性氧的产生，增强清除自由基的性能[14-15]。本试验发现，白藜芦醇可以抑制氧化应激标记（MDA）的产生，显著提高CAT、SOD和GPX活性。GPX、CAT和SOD构成最初的抗氧化防御系统，CAT和GPX之间有一定的互补作用[16]。CAT能够清除动物机体产生的多余过氧化氢，保护细胞免受伤害；SOD能够减轻超氧自由基的毒性作用[17]。超氧物是1种在生物过程中产生的自由基，可以作为其他活性氧的前体[12,18]，如过氧化氢、羟基自由基以及在启动脂质过氧化中起着重要作用的超氧物[13]。Cheng等[10]研究表明，日粮中添加白藜芦醇能够降低生长猪（MDA）含量，提升机体的抗氧化能力。有研究发现，添加白藜芦醇可以增加肉鸡胸大肌肌肉中的抗氧化能力[19]。上述研究结果与本试验一致。本试验中，添加白藜芦醇可以提高CAT、GPX和SOD等抗氧化酶活性，表明白藜芦醇对超氧物、过氧化氢和羟基具有清除作用，可以改善肌肉组织的抗氧化状态。随着白藜芦醇含量的增加，200、400、600 mg/kg组的GPX、CAT和SOD的基因表达增加，其中600 mg/kg组与对照组相比最显著。3.2白藜芦醇对生长猪背最长肌Keap1-Nrf2信号通路的影响Keap1-Nrf2信号通路是众多抗氧化通路中占主要作用的1个信号通路，Nrf2可以通过转录激活抗氧化反应元件（ARE）的基因来调节细胞内的抗氧化剂[20]。有研究表明，在氧化应激的第1阶段，Nrf2通过与细胞质中含有半胱氨酸残基的抑制蛋白Keap1分离被激活，具体表现为Keap1与氧化性和亲电性自由基反应，导致构象变化和Nrf2的释放[21]。本研究中，日粮添加白藜芦醇能够促进生长猪背最长肌Nrf2基因和蛋白表达水平升高，Keap1基因表达水平降低，说明日粮中添加白藜芦醇激活Keap1-Nrf2通路，从而上调通路抗氧化基因CAT和SOD的基因表达。此外，Meng等[11]研究日粮添加白藜芦醇对母猪和仔猪抗氧化状态的影响，发现白藜芦醇可以提高Nrf2表达，进而提升胎盘中的抗氧化能力。结果表明，日粮中添加白藜芦醇可以通过激活Nrf2信号通路，改善动物机体的抗氧化能力，减轻机体的氧化应激。有研究表明，低剂量白藜芦醇（5.9 mg/kg体重）可以被育肥猪吸收和代谢，并可在肌肉和血浆中检测到[22]。高剂量的白藜芦醇没有危害[23]。本试验发现，与对照组相比，600 mg/kg的白藜芦醇可以更有效地抑制生长猪肌肉Keap1基因表达，激活Nrf2提高CAT、T-SOD和GSH-Px相关基因表达量，改善生长猪背最长肌的抗氧化能力。4结论本研究表明，白藜芦醇可以通过调节Nrf2-Keap1通路，在一定程度上增强生长猪背最长肌肌肉组织的抗氧化能力。