抗生素在防治畜禽消化道疾病、提高生产性能方面发挥重要作用。但是，抗生素滥用带来的病原菌耐药、兽药残留和环境污染等问题，严重影响畜产品的品质和人类健康，危害全球公共安全[1]。宿主防御肽具有广谱抗菌、抗病毒和免疫调节作用，可以用来“替抗”“减抗”。β-防御素是猪宿主防御肽家族的重要组成部分。技术和成本的限制使宿主防御肽无法被大量提取和规模化生产。目前，利用外源性营养物质诱导内源性宿主防御肽的表达是一种经济且有效的策略，受到越来越多的关注[2-3]。丁酸、氨基酸、益生菌、维生素和多糖类等营养成分均可不同程度诱导宿主防御肽的生成[4-5]。研究表明，不同宿主防御肽诱导剂之间存在一定的协同作用，如乙酸、丙酸与丁酸可协同增强禽内源性宿主防御肽基因的表达；丁酸与环磷酸酰苷联合使用对禽β-防御素-9的产生具有极显著的协同诱导作用[6]。丁酸是迄今为止发现的最有效的宿主防御肽刺激因子[7]。维生素D3（VD3）及其代谢产物被认为是炎症反应的开关，也可诱导多种宿主防御肽的生成[8]，但丁酸钠与VD3联合使用对猪β-防御素的表达是否协同作用尚不明确。本试验研究丁酸钠与VD3联合使用对猪β-防御素-3（pBD3）表达的影响，为丁酸钠更有效地用于生产实践提供参考。1材料与方法1.1试验材料猪小肠上皮细胞（IPEC-J2）由农业部饲料工业中心惠赠；丁酸钠、VD3均购自Sigma公司；RNA提取试剂盒、反转录试剂盒、荧光定量试剂盒均购自北京天根生物科技有限公司；荧光定量PCR仪购自美国罗氏公司。1.2试验方法1.2.1试验设计IPEC-J2细胞铺满六孔板底层80%。试验分为4组，分别是对照组、丁酸钠处理组、VD3处理组、丁酸钠+VD3联合使用组。对照组不做任何处理。丁酸钠组：细胞培养液中分别添加1、2、4、8、16、32 mmol/L丁酸钠处理细胞，每个浓度设3个重复孔。VD3组：细胞培养液中添加2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的VD3处理细胞，每个浓度设3个重复孔。丁酸钠+VD3组：培养基添加2 mmol/L丁酸钠，同时添加0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L的VD3处理细胞，每个浓度设3个重复孔。1.2.2IPEC-J2细胞处理方法丁酸钠添加方法：丁酸钠利用过滤除菌的去离子水配制储备液。相同数目细胞接种于六孔板中，培养至细胞铺满底层80%时用于试验。吸弃培养液，PBS洗2~3次，更换培养液，加入丁酸钠溶液，使培养基内丁酸钠的终浓度分别为1、2、4、8、16、32 mmol/L。培养24 h，收集细胞，按照RNA提取试剂盒的方法提取RNA，定量，反转录得到cDNA，-20 ℃保存，待检测。VD3添加方法：VD3利用乙醇溶解后配制成储备液。细胞接种于六孔板中后，培养至细胞铺满底层80%时，更换培养液，加入VD3溶液，使培养基终浓度分别为2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L。培养24 h，收集细胞，按照RNA提取试剂盒方法提取RNA，定量，反转录得到cDNA，-20 ℃保存，待检测。丁酸钠+VD3添加方法：细胞于六孔板中培养至细胞铺满底层80%时，吸弃培养液，PBS洗2~3次，加入丁酸钠溶液和VD3溶液，使培养基内丁酸钠溶液为2 mmol/L，VD3的终浓度分别为0、2.5、5.0、10.0、20.0、40.0 μmol/L，培养24 h，收集细胞，按照RNA提取试剂盒方法提取RNA，定量，反转录得到cDNA，-20 ℃保存，待检测。对照组和试验组RNA提取后使用1%琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测，RNA样品电泳条带清晰且紫外分光光度计检测A260 nm/A280 nm的比值在1.8~2.0之间时，可用于下一步试验。1.2.3PCR引物设计与合成参照Gen-Bank中所提供的基因序列设计特异性引物，内参为GAPDH。目的基因及内参基因引物由生工生物工程（北京）股份有限公司设计合成，目的基因及内参基因引物序列见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.025.T001表1目的基因及内参基因引物序列基因前端引物（5'-3'）后端引物（5'-3'）大小/bpGAPDHCCCCTTCATTGACCTCCACTTGGAAGATGGTGATGGCCTT129pBD3CCTTCTCTTTGCCTTGCTCTTGCCACTCACAGAACAGCTACC1631.2.4荧光定量PCR检测pBD3基因表达水平用荧光定量PCR仪检测各试验组pBD3 mRNA的表达水平，对每个样品cDNA进行目的基因和内参基因荧光定量PCR反应，每个样品设3个重复。PCR反应采用20 μL体系，荧光量PCR反应体系见表2。反应条件为：95 ℃预变性10 min、95 ℃变性10 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，40个循环。PCR扩增反应结束，根据扩增曲线的CT值计算定量结果。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.025.T002表2荧光量PCR反应体系试剂使用量合计20Mix（2X）10Primer-F1Primer-R1cDNA4ddH204μL1.3数据统计与分析目的基因pBD3的CT值与内参基因GAPDH的CT值之差为目的基因pBD3的△CT值，按照此原则计算出试验组与对照组目的基因pBD3的△CT值。试验组与对照组的△CT值之差为目的基因pBD3的△△CT值。按照基因的相对表达水平＝2-△△CT，计算出对照组与试验组相对表达水平。以“平均值±标准差”表示。采用GraphPad Prism 8分析作图。2结果与分析2.1不同浓度丁酸钠对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响（见图1）由图1可知，随着丁酸钠浓度升高，IPEC-J2细胞pBD3表达呈现出先升高后降低的趋势，且各个浓度处理的表达量均显著高于对照组，其中4 mmol/L丁酸钠处理组pBD3表达最高，丁酸钠浓度与IPEC-J2细胞pBD3表达呈现出一定的剂量相关性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.025.F001图1不同浓度丁酸钠对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响2.2不同浓度VD3对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响（见图2）由图2可知，VD3处理后pBD3表达与对照组相比没有显著性差异。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.025.F002图2不同浓度VD3对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响2.3丁酸钠+VD3对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响（见图3）由图3可知，随着VD3浓度的增加，丁酸钠对pBD3表达的呈现出较强的剂量相关性。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.025.F003图3丁酸钠与VD3联用对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响2.4VD3、丁酸钠+VD3对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响比较（见表3）由表3可知，丁酸钠与VD3联合使用具有协同作用。与VD3组相比，丁酸钠+VD3处理对IPEC-J2细胞pBD3表达差异显著。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.025.T003表3VD3、丁酸钠+VD3对IPEC-J2细胞pBD3表达的影响比较组别0 μmol/L2.5 μmol/L5.0 μmol/L10.0 μmol/L20.0 μmol/L40.0 μmol/LVD3组1.001.43±0.53a1.04±0.11a1.08±0.15a1.69±0.39a1.14±0.35a丁酸钠+VD3组14.03±0.9419.30±0.73b19.85±3.54b22.61±3.30b34.68±4.98b29.39±4.80b注：同列数据肩表小写字母不同表示差异显著（P0.05），小写字母相同或无字母表示差异不显著（P0.05）。3讨论本试验结果表明，丁酸钠可以诱导IPEC-J2细胞pBD3的表达，在一定的浓度范围内，诱导作用与添加浓度呈正相关，这与Zeng等[7]报道一致。随着细胞培养基中丁酸钠添加浓度进一步增加，丁酸钠对IPEC-J2细胞的诱导作用呈现出下降趋势，这可能与丁酸钠浓度过高改变细胞的生长环境，影响细胞的代谢有关，其机理有待进一步研究。Weiss等[9]报道，VD3对多种细胞宿主防御肽的表达具有诱导作用，但本试验中，VD3对IPEC-J2细胞pBD3调控作用不显著，这可能是物种及细胞之间的差异性所致。张龙[10]研究发现，VD3可与丁酸钠协同诱导鸡β－防御素-9的表达，采用10-8 mol/L的1，25二羟基VD3（VD3的体内代谢产物）和2 mmol/L丁酸钠分别处理鸡巨噬细胞系HD11，可使禽的β-防御素-9的表达量提高约2.5倍和600倍；二者同时添加可使禽的β-防御素-9的表达量提高4 900倍。本试验中，丁酸与VD3联合使用，也显著增强IPEC-J2细胞pBD3的表达，这与上述报道的相一致，但其协同效果并未出现上述文献中提高的几千倍的效果。宿主防御肽的表达受多种信号通路的精细调控，如Toll样受体信号通路、MAPK信号通路、NF-κB信号通路、组蛋白去乙酰化修饰途径等[11-12]。丁酸可以直接修饰组蛋白诱导宿主防御肽的表达[13]；通过Toll样受体信号通路介导猪肠道上皮细胞宿主防御肽的表达[14]；通过激活NF-κB等通路诱导宿主防御肽的表达。VD3调控抗菌肽表达的调控机制还与VD受体（VDR）密切相关[15]，VDR在VD3调控抗菌肽表达过程中发挥重要作用。Robinson等[16]报道，VD3及其活性代谢产物也是通过激活VD受体（VDR）来诱导宿主防御肽的表达，VDR在二者协同作用方面发挥了重要作用，但其机制尚待进一步研究。4结论丁酸钠与VD3联合使用对IPEC-J2细胞宿主防御肽β-防御素3 mRNA基因的表达具有显著的协同作用，协同作用的强度与VD3的添加剂量呈相关性，其协同作用机理尚待进一步研究。