近年来,消费者对转基因产品关注程度的不断上升,有关转基因产品的争论日益激烈。含有转基因成分的产品在生产加工过程中,经酸浸、高温加热烘干、粉碎等程序,其核酸成分受到不同程度的破坏[1],使检验更加困难,检验结果的准确度受到很大影响。如何在现有的检验方法基础上更有效地检测出转基因成分成为重要问题。我国玉米产量的15%用于生产淀粉、玉米蛋白粉(corn gluten meal)、喷浆玉米皮(corn gluten feed)。近年来,黑龙江省喷浆玉米皮、喷浆玉米皮饲料产品的出口额度逐年增加,主要出口国家为俄罗斯、韩国、日本等。在进出口贸易中对转基因产品含量的要求有着严格的规定,不同国家对于进口饲料的转基因含量要求不同,欧盟规定饲料转基因含量小于0.9%,韩国小于3%,日本小于1%,俄罗斯则规定不得含有转基因成分。现行SN/T 1201—2014《饲料中转基因植物成分PCR检测方法》标准为转基因成分定性检测方法,标准中规定玉米类饲料产品需检测内源基因ZEIN、zSSⅡb、tRNAleu(任选其一,其中ZEIN、zSSⅡb为玉米内源基因,tRNAleu为高等植物内源基因),外源基因CaMV35S(启动子)、Nos(终止子)[2]。核酸成分在生产加工过程中受到不同程度的破坏,因此影响上述基因的检测[3-4]。试验研究喷浆玉米皮在生产加工过程中内源基因、外源基因的降解情况,找出最佳的检测方案,提高喷浆玉米皮这类饲料产品转基因成分检测的准确度。1材料与方法1.1检测原理转基因饲料定性检测是利用外源基因与植物本身基因的不同,通过设计只能扩增外源基因中DNA片段的引物和进行PCR扩增,根据试验结果,判定该饲料是否带有外源基因成分。1.2仪器与试剂qTOWER2.2耶拿荧光定量PCR、ESCO AB2-4S1生物安全柜、Malcome-spect核酸蛋白分析仪。引物5PRIME FAM 3PRIME TAMER(Invitrogen公司)、探针5PRIME FAM 3PRIME TAMER(Invitrogen公司)、Light Cycler 8-Tube Strips(white)(Roche公司)、AOCS MON810标准品(阳性对照)、Foodproof GMO Sample preparation kit(Biotecon 公司的提取试剂盒)、Premix Ex Taq(Probe qPCR)(Takara公司)。1.3试验方法1.3.1方法依据试验参考SN/T 1201-2014《植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法》。1.3.2喷浆玉米皮工艺流程喷浆玉米皮工艺流程为:原料玉米在(50±2)℃温度下,采用0.07%~0.18%的亚硫酸浸泡(浸泡时间≥26 h),破碎、胚芽分离、精磨,得精浆液和纤维。将纤维洗涤、脱水、喷浆(干物质含量为45%玉米浆)、干燥,即为喷浆玉米皮。喷浆玉米皮工艺流程见图1。根据此工艺流程,选取5个关键工艺点,即:原料玉米、酸浸后玉米、精磨后玉米、脱水后纤维、喷浆玉米皮。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F001图1喷浆玉米皮工艺流程1.3.3样品中DNA提取根据Foodproof GMO Sample preparation kit提取试剂盒说明书的方法提取喷浆玉米皮中DNA。称取200 mg喷浆玉米皮于2 mL微量离心管中,加入提取缓冲液,涡旋混合30 s,80 ℃温育30 min。在温育过程中颠倒混合2~3次反应管,如果食品样本吸收了提取缓冲液,补充一些提取缓冲液。13 000×g离心10 min。在一个新的2 mL微量离心管中,加入400 μL结合缓冲液。吸取离心后上清液1 mL到这个新的含有结合缓冲液的2 mL离心管中,轻柔彻底地反复吸打,使之混合均匀。加入预热70 ℃的蛋白酶K操作液80 μL,轻柔彻底地反复吸打,使之混合,72 ℃温育10 min。加入200 μL异丙醇并反复吸打,充分混匀。将混合液加入过滤管与收集管结合管的上层位置,微型离心机5 000×g离心1 min,弃去下层废液。将剩余的混合液放入同一支过滤管中并重复离心步骤,弃去下层废液。加400 μL清洗缓冲液操作液至上层储液器中,6 000×g离心1 min,弃去下层废液,再加入400 μL清洗缓冲液操作液至上层储液器中,6 000×g离心1 min,弃去下层废液,13 000×g离心10 s移除残留的清洗缓冲液。离心后将过滤管放入一个干净的1.5 mL反应管中。将60 μL预热70 ℃的洗脱液放入玻璃纤维绒膜之上,15~25℃温育5 min,6 000×g离心1 min。离心管中为洗脱下来的DNA。将提取出的样品中的DNA用核酸蛋白分析仪进行DNA含量的测定。1.3.4内源基因、外源基因在加工过程中降解情况的研究根据SN/T 1201—2014《植物性饲料中转基因成分定性PCR检测方法》标准中方法,试验过程中采用的反应程序为试剂说明书中要求的反应程序:95 ℃ 30 s、95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s,40 个循环(Premix Ex Taq)。检测内源基因ZEIN、zSSⅡb、tRNAleu(其中ZEIN、zSSⅡb为玉米内源基因,tRNAleu为高等植物内源基因),外源基因CaMV35S(启动子)、Nos(终止子)。试验设置阳性对照、水空白对照及阴性对照。1.3.5标准曲线的建立将提取后的MON810标准品(含量为99%)DNA分别制成50.0%、25.0%、12.0%、6.0%、3.0%、1.0%、0.8.0%的标准品,然后对这些不同含量的标准品进行Ct值测定,得出标准曲线公式,根据标准曲线公式,得到待测样品的转基因成分的百分含量。2结果与分析2.1样品中DNA提取结果5个关键工艺阶段样品的提取前称样量、提取后核酸浓度及DNA纯度比值见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.T001表15个关键工艺阶段样品的提取前称样量、提取后核酸浓度及DNA纯度比值样品名称称样量/mg核酸浓度/(mg/L)DNA纯度/(A260/280)原料玉米199669.411.838酸浸后玉米202139.221.595精磨后玉米20041.121.308脱水后纤维19999.821.361喷浆玉米皮207162.191.454由表1可知,酸浸对玉米核酸造成很大破坏,核酸浓度明显下降,杂质含量升高使DNA纯度明显下降,DNA中含有的盐离子等杂质也会对PCR扩增有抑制作用[5-7]。经过洗涤、脱水后得到的纤维,再经过喷浆、干燥得到喷浆玉米皮,所以喷浆玉米皮的核酸浓度及DNA纯度较精磨后玉米要高。2.2内源基因、外源基因在加工过程中降解情况的结果对提取出的5个关键工艺阶段样品核酸分别检测内源基因ZEIN、zSSⅡb、tRNAleu(其中ZEIN、zSSⅡb为玉米内源基因,tRNAleu为高等植物内源基因),外源基因CaMV35S(启动子)、Nos(终止子)。其中外源基因的进样量分别选取2、4、6、8 μL,试验设置阳性对照、水空白对照及阴性对照。内源基因ZEIN、zSSⅡb、tRNAleu的Ct值见图2。外源基因CaMV35S、Nos的Ct值见图3。图2内源基因ZEIN、zSSⅡb、tRNAleu的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F002(a)内源基因ZEIN的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F003(b)内源基因zSSⅡb的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F004(c)内源基因tRNAleu的Ct值图3外源基因CaMV35S、Nos的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F005(a)外源基因CaMV35S进样量2 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F006(b)外源基因CaMV35S进样量4 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F007(c)外源基因CaMV35S进样量6 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F008(d)外源基因CaMV35S进样量8 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F009(e)外源基因Nos进样量2 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F010(f)外源基因Nos进样量4 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F011(g)外源基因Nos进样量6 μL的Ct值10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F012(h)外源基因Nos进样量8 μL的Ct值由图2、图3可知,5个关键工艺阶段样品内源基因(ZEIN、zSSⅡb,tRNAleu)变化基本一致,且与核酸浓度成正比。精磨后玉米样品的Ct值最低,因为酸浸对玉米核酸造成很大破坏;洗涤、脱水后得到的纤维及再经过喷浆、干燥得到喷浆玉米皮,它们的Ct值较精磨后玉米的Ct值有所升高,因为工艺流程去除了酸及其他杂质的影响,且喷浆中含有少量核酸增加样品的核酸浓度,提高样品Ct值。5个关键工艺阶段样品的3种内源基因Ct值的平均值比较:tRNAleuzSSⅡbZEIN,说明加工过程对内源基因ZEIN的破坏较大,内源基因zSSⅡb其次,内源基因tRNAleu受破坏最小。5个关键工艺阶段样品外源基因(CaMV35S、Nos)变化基本一致,且不同进样量的Ct值变化基本相近,与3种内源基因Ct值变化一致。2.3标准曲线提取后MON810标准品的DNA浓度为978.61 mg/L,DNA纯度A260/280为1.936。制成含量为50.0%、25.0%、12.0%、6.0%、3.0%、1.0%、0.8%的标准品,测定这些不同含量标准品的Ct值,标准曲线见图4。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.F013图4标准曲线由图4可知,回归方程为:y=-3.41x+37.14(R2=0.998 39)。5个关键工艺阶段样品核酸按照不同进样量分别测得外源基因CaMV35S、Nos的Ct值相近,故选取Ct值的平均值带入公式,计算出样品转基因成分的百分含量,5个关键工艺阶段样品转基因成分的百分含量见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.020.T002表35个关键工艺阶段样品转基因成分的百分含量样品进样量2 μL进样量4 μL进样量6 μL进样量8 μL原料玉米99999999酸浸后玉米61746573精磨后玉米12232121脱水后纤维80848685喷浆玉米皮33564637%由表3可知,酸浸对玉米核酸破坏很大。洗涤、脱水后得到纤维的转基因百分含量显著升高,因为洗涤脱水去除了酸及其他杂质的影响。喷浆、干燥得到的喷浆玉米皮百分含量又有所下降,因为喷浆中为干物质含量为45%玉米浆,玉米浆经酸浸后核酸也遭到很大了破坏,且含有其他杂质,影响喷浆玉米皮的核酸纯度及百分含量。原料玉米的Ct值比MON810标准品的Ct值要高,百分含量也高,说明此原料玉米样品为纯转基因样品。进样量为2、4、6、8 μL时,其百分含量基本一致,说明进样量的增加对百分含量的测定无影响。3讨论饲料组成成分复杂,不同的饲料原料经过加工以后降解变化情况的差异性很大。研究发现,粉碎和青贮不能降解饲料中的DNA;加工温度高于95 ℃、加热时间在5 min以上,饲料的DNA就会发生降解现象;采用高、低压蒸汽处理30 s以上也能使DNA降解。饲料工业中迅速发展的膨化工艺,也会一定程度地降解饲料中的DNA。在食品加工中温度和pH值是影响DNA降解的两个重要参数。有研究进行质粒和植物DNA的降解研究,结果表明DNA的刻痕随pH值的降低而显著增强。本试验结果与上述研究结果一致,喷浆玉米皮在生产加工过程中受到了pH值很大影响[8-12]。4展望转基因作物饲料的安全性受到越来越多的关注,要减少外源基因传播的可能性,保证其安全性,就必须要严格控制加工条件,改善检测方法。随着转基因成分检测手段的不断提高和数字PCR的开发及应用,可以利用数字PCR技术进行饲料转基因成分痕量检测,不仅能定性检测转基因成分,并且能定量检测出DNA含量。

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