市售的酶制剂种类繁多。依据酶源特性，酶制剂可分为消化酶和非消化酶。消化酶主要指畜禽自身能够分泌的淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶等；非消化酶如非淀粉多糖酶、植酸酶等多来自微生物的一类酶制剂[1]。按照酶组成，酶制剂分为单一酶和复合酶[2]。酶制剂也可以依据养殖畜禽类型以及日粮等进行分类[3]。在全球禁抗趋势下[4]，酶制剂作为一类可以替代促生长型抗生素的绿色、安全、无残留的新型饲料添加剂，在畜牧养殖业中得到广泛应用。酶制剂能够提高饲料消化率，拓宽饲料原料来源[5]；减轻畜禽排泄废物中的有机物、氮和磷的排泄量[6]，改善养殖环境；减少肠道有害微生物，促进有益菌增殖，维持肠道稳态[7]；间接调节机体免疫，提高畜禽生产性能等[8]。在实际应用中，饲用酶制剂也存在一些问题，如单酶酶活定义及测定方法混乱[9]、酶制剂耐受性较差[10]、到达机体的“有效酶活”无法预测和衡量、缺乏底物和动物的针对性[11]。研究表明，在低蛋白日粮背景下，蛋白酶的添加可以提高蛋白质利用率[12]。直接进行动物性试验进行筛选评估，工作量巨大、耗时、耗力。动物试验前，有必要先进行实验室筛选。对于生产性企业，如何从繁多的蛋白酶产品中筛选适合的品种，需要建立一套评估体系。文章根据畜禽生理特点及饲料制粒工艺建立实验室体外评估方法，为动物试验提供参考。1材料与方法1.1试验材料1.1.1试验试样酸性蛋白酶试样：AS、BS、CS、DS（固态发酵）、ES；中性蛋白酶试样：AZ、BZ、CZ、DZ（固态发酵）；禽用复合酶试样酶：AF（肉鸡蛋白酶）、BF家禽专用复合酶、CF家禽专用组合蛋白酶；Xf为某养殖公司正在采用的家禽专用蛋白酶产品，以上试样均为市售产品。1.1.2试验试剂根据中国药典配制人工模拟胃液，取浓盐酸23.4 mL加水100 mL配制成稀盐酸。取上述稀盐酸1.64 mL，加水约80 mL与胃蛋白酶1 g（比活力1∶3 000）混匀，加水稀释成100 mL，调节其pH值为2.5。豆粕∶玉米比例为3∶7。1.2试验方法1.2.1单一蛋白酶酶活测定中性蛋白酶参照GB/T 23527—2009测定；酸性蛋白酶参照GB/T 28715—2012测定。1.2.2单一蛋白酶稳定性评价1.2.2.1单一蛋白酶耐温性评估饲料酶制剂需要符合饲料高温制粒情形（粉状饲料不需考虑），模拟饲料制粒条件很关键。调节酶制剂水分25%、80 ℃，水浴处理2 min，放置室温，采用1.2.1中国标法测定剩余酶活力。1.2.2.2单一蛋白酶耐酸和耐胃蛋白酶评估pH值会影响酶的稳定性。猪的胃pH值为1.5~3.5。如果蛋白酶不能耐受胃酸，其发挥作用非常有限。故需在体外模拟胃环境条件[13]。酸性蛋白酶：在人工模拟胃液环境中，40 ℃处理1.5 h，采用GB/T 28715—2012测定剩余酶活。中性蛋白酶：在人工模拟胃液环境中，40 ℃处理1.5 h，然后调回pH值7.0，继续反应30 min，采用GB/T 23527—2009测定剩余酶活。1.2.3禽用复合蛋白酶评估方案1.2.3.1禽用复合酶中各蛋白酶单酶酶活的测定酸性蛋白酶、中性蛋白酶酶活测定方法见1.2.1。碱性蛋白酶测定方法参见GB/T23527—2009。1.2.3.2禽用复合酶中各蛋白酶单酶耐温性测定测定方法见1.2.2。1.2.3.3复合酶对玉米豆粕分解力的测定酶的活性与底物有重要关系，试验过程依据养殖所用日粮的实际情况选择酶的作用底物。本研究采用玉米-豆粕型日粮。取20 g配合日粮，加入100 g水，分别加入0.1 g的复合酶，搅拌均匀，40 ℃，pH值7.5，反应1.5 h，反应结束后测定酸溶蛋白（干基重）。观察pH值、颜色、气味、浑浊度的变化。酸溶蛋白测定方法：取3 g样品用15%的三氯乙酸定容至50 mL容量瓶，摇匀，静置5 min，采用定性滤纸过滤，取10 mL滤液至凯氏烧瓶中，采用凯氏定氮法测定，具体操作和计算参照GB/T 6432—1994[14]。1.2.3.4复合酶对物料黏度的影响。食糜黏度与营养物质的吸收呈负相关性，与日粮中可溶性非淀粉多糖呈正相关[15]。为增加营养物质的消化与吸收，复合酶中除了蛋白酶外，还可能复配一部分的非淀粉多糖酶（NSP酶）来降解可溶性非淀粉多糖，降低食糜黏度。取2 g复合酶制剂取20 g豆粕-玉米日粮，加入100 g水，调节pH值6.5，搅拌均匀。40 ℃水浴处理4 h，采用黏度仪测定其黏度变化。同时做空白对照。1.3数据统计与分析所有酶活测定，在重复条件下获得的2次独立测定结果的绝对差值不应超过平均值的3%。所有使用重复3次，数据结果以平均值表示。2结果与分析2.1蛋白酶单酶酶活测定及耐受性分析（见表1~表4）由表1可知，各试样酶活高低依次为ES、AS、BS、CS、DS。饲料酶制剂最终要在动物生长中发挥作用，需要经过饲料加工制粒、动物胃肠道、胃蛋白酶等的考验。所以，即使酶制剂活性测试很高，也未必能够在动物的生产性能中反映出来[16]。酶活越高的酶制剂质量越好这种说法并不科学，酶活测定仍然是评价酶制剂优劣的可行性方法[15]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T001表1酸性蛋白酶酶活测定试样名称标注酶活/（万U/g）实测酶活/（万U/g）ES57.270AS5.265BS4.660CS3.280DS2.785由表2可知，各酸性蛋白酶经过高温处理，酶活均有损失。DS（固态发酵）损失的最少，其耐热性最好。ES经过热处理后，酶活损失达到77.3%，其耐热性最差。各酸性蛋白酶单酶对人工模拟胃液中的酸性环境和胃蛋白酶具有一定的耐受性，其中ES的耐受性最差，其酶活损失率高达81.22%；而BS耐受性较好，其酶活损失率34.12%综合处理1和处理2，对各厂家酸性蛋白酶进行初步排序，DS、BS＞CS＞AS＞ES。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T002表2酸性蛋白酶耐受性测定试样名称处理1的酶活/（万U/g）酶活损失率/%处理2的酶活/（万U/g）酶活损失率/%ES1.45081.221.65077.30AS1.63069.041.69067.90BS1.63034.121.59065.88CS1.27061.281.36058.54DS（固态发酵）1.28553.681.39050.09注：处理1：耐酸耐胃蛋白酶试验；处理2：耐温性试验。由表3可知，各中性蛋白酶实测酶活与标注酶活均不相同。实测酶活高低依次为AZ＞BZ＞CZ＞DZ。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T003表3中性蛋白酶酶活测定试样名称标注酶活/（万U/g）实测酶活/（万U/g）AZ10.010.38BZ5.07.88CZ5.06.63DZ（固态发酵）0.80.46由表4可知，各中性蛋白酶经过高温和胃酸、胃蛋白酶处理，酶活均有损失。对于DZ（固态发酵），其对两者的耐受性均较强，其酶活损失分别为52.3%、44.27%。而AZ试样更耐热，其高温处理，酶活损失为22.35%。CZ对两者的耐受性均较弱，其热处理后，酶活损失72.1%，酸、胃蛋白酶处理后，酶活损失74.51%。综合处理1和处理2，对各中性蛋白酶进行初步排序，DZ（固态发酵）＞AZ＞BZ、CZ。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T004表4中性蛋白酶耐受性测定试样名称处理1后的酶活/（万U/g）酶活损失率/%处理2的酶活/（万U/g）酶活损失率/%AZ2.92071.878.00022.35BZ1.69067.461.63879.21CZ1.43574.511.85072.10DZ（固态发酵）0.25044.270.22052.30注：处理1：耐酸耐胃蛋白酶试验；处理2：耐温性试验。2.2禽用复合蛋白酶酶中蛋白酶酶活及其耐受性的测定（见表5、表6）由表5可知，禽用复合酶主要由中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成。其中，XF、AF、BF三种复合酶试样均由酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成。CF仅由中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成。可能是家禽胃部酸性环境不强的原因。与XF相比，AF、BF的酸性蛋白酶较其略微不足。综合判断，AF的蛋白酶组成更接近于XF。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T005表5禽用复合蛋白酶中蛋白酶单酶酶活的测定试样名称酸性蛋白酶实测酶活/（万U/g）中性蛋白酶实测酶活/（万U/g）碱性蛋白酶实测酶活/（万U/g）XF0.979 22.160 01.125 0AF0.732 31.135 01.820 0BF0.717 31.085 04.720 0CF08.425 025.300 0家禽对胃酸的耐受性要求比较低，故家禽用复合酶评估时，其对胃酸的耐受性不做重点考虑[2]。由表6可知，与XF相比，AF的酸性蛋白酶热处理后，酶活损失10.49%，接近于XF的6.28%。AF、BF、CF中的碱性蛋白酶的热处理酶活损失率分别为25.27%、25.66%和18.52%，均略高于其的13.56%。但是对于中性蛋白酶，AF、BF的损失率18.93%、13.03%，均明显低于XF、CF的43.56%、44.57%。综上所述，与XF耐热性相当的为AF。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T006表6禽用复合蛋白酶中蛋白酶单酶耐热性的测定试样名称酸性蛋白酶热处理后的酶活/（万U/g）损失率/%中性蛋白酶热处理后的酶活损失率/%碱性蛋白酶热处理后的酶活损失率/%XF0.917 76.281.219 043.560.972 513.56AF0.655 510.490.920 118.931.360 025.27BF0.364 449.200.943 613.033.509 025.66CF0—4.655 044.7520.615 018.522.3禽用复合酶对玉米豆粕分解力的测定（见表7）由表7可知，相较于空白对照，各复合酶试样对日粮中蛋白均具有降解作用。其中XF的降解作用最好，其次为AF，其作用后的酸溶蛋白为2.16%。综上所述，相较于XF从组合蛋白酶耐受性和酶解玉米豆粕原料后酸溶蛋白含量评价，AF＞BF＞CF。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T007表7禽用复合蛋白酶对玉米豆粕日粮中蛋白降解组别酸溶蛋白含量/%XF2.250AF2.160BF1.650CF1.470空白对照0.7242.4禽用复合酶对物料黏度的影响（见表8）外源性非淀粉多糖酶能够降低食糜黏度，使外源蛋白酶和内源酶更好地接近底物，提高饲料利用率。由表8可知，相较于空白21.90 mPa·s，XF、AF、BF对物料的黏度均具有一定的作用，但是并不是特别明显，这可能与日粮类型有关，玉米-豆粕型日粮属于低黏度日粮，也可能是复合酶中含NSP酶较少[4]。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.024.T008表8禽用复合蛋白酶对玉米豆粕日粮黏度的影响组别黏度/（mPa·s）XF13.00AF18.00BF20.00CF23.16空白对照21.903讨论酶制剂要想在畜禽体内发挥作用，必须在到达其作用部位时，保留一定活性。白燕[17]测定肉仔鸡消化道参数设定体外消化法中的pH值、消化酶和含水量水平，评估粗蛋白体外消化率。该评估体系考虑了pH值、消化酶对饲用蛋白酶的影响，但是并未考虑饲用酶制剂在饲料制粒过程中的高温处理对其的破坏。同一或不同来源酶制剂及不同的工艺处理，酶制剂相关酶活及其作用存在差异，且酶制剂的耐热性也不尽相同。耐高温主要取决于生产酶公司对菌种耐热方面的研发和筛选能力。本试验没有研究酶制剂对胰蛋白酶抑制因子和矿物质的耐受性。但是豆粕中的胰蛋白酶抑制因子对胰蛋白酶的影响非常大[18]。矿物质对蛋白酶酶活也有影响。因此，可以考虑某些添加量比较大的矿物质对其的影响，如Cu2+和Fe2+。基于上述考虑，在动物试验前，可以再次以胰蛋白酶抑制因子和矿物质耐受性为指标，进行复筛。本方法有利于从繁多的蛋白酶产品中，初筛出较优品种。但仍需结合动物实验确定最优品种。总之，优良酶制剂的选择，要兼顾考虑饲养对象、所用日粮种类、酶活力不浪费等。4结论根据畜禽生理特点及饲料制粒过程建立的酶制剂实验室体外评估方法测得：蛋白酶酶活高低依次为ES、AS、BS、CS、DS；对热、胃酸及胃蛋白酶耐受性强弱依次为DS、BS＞CS＞AS＞ES。各中性蛋白酶实测酶活与标注酶活，均不相同。其酶活高低依次为AZ＞BZ＞CZ＞DZ。对热、胃酸及胃蛋白酶耐受性强弱排序为DZ（固态发酵）＞AZ＞BZ、CZ。XF、AF、BF三种复合酶试样均由酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成。CF仅由中性蛋白酶和碱性蛋白酶组成。与XF相比，AF与其组成更接近。各中性蛋白酶经过高温、胃酸及胃蛋白酶处理，酶活均有损失。从耐受性及酶解玉米豆粕能力评价依次为AF＞BF＞CF。各酶试样对物料的黏度降低作用并不明显。该评估方法有利于从繁多的蛋白酶产品中，初筛出较优品种，但仍需结合动物试验确定最优品种。