在反刍动物瘤胃代谢过程中，根据日粮营养水平及组成不同，约有2%~15%的饲料能量以甲烷（CH4）的形式损失掉[1]。CH4对全球气候变暖的影响占所有影响气候变暖因素的15%~20%，CH4的温室效应是二氧化碳的62倍[2]。调控反刍动物CH4排放对环境保护和动物生产具有双重意义。反刍动物饲料消化过程中微生物发酵产生CH4。CH4能阻止氢积累引起的瘤胃异常代谢，但CH4的产生代表饲料能量损失和造成温室效应。因此，减少CH4排放一直是确保反刍动物生产可持续性的重要目标。产甲烷古菌在发酵饲料的过程中产生CH4。原虫可以作为氢的供体，减少原虫可以减少CH4产生[3]。瘤胃微生物包括细菌、原生动物、古细菌和真菌[4]，其组成数量与反刍动物的生产效率和健康密切相关[5]。日粮中添加油脂会改变瘤胃微生物群落结构[6]，日粮中添加多不饱和脂肪酸会影响瘤胃pH值、VFA和微生物结构[7]。日粮中添加油脂能够减少瘤胃原生动物数量，从而减少瘤胃中CH4的产生[8]。不饱和脂肪酸能够降低瘤胃甲烷菌的活性，在生物加氢过程中利用氢气[9]。有研究发现，脂肪酸的作用取决于其组成，只有油酸（C18∶1n-9）、亚油酸（C18∶2n-6）和α-亚麻酸（C18∶3n-3）会减少CH4的产生[10-11]。研究拟选取添加不同比例亚油酸和亚麻酸作为脂肪酸供体，探究在体外培养方式下水牛瘤胃发酵参数和微生物区系的变化，以期为不饱和脂肪酸在水牛生产上的应用提供参考。1材料与方法1.1试验材料试验用亚油酸购自sigma公司（货号：L1376），亚麻酸购自Sigma公司（货号：L2376）。1.2试验设计按照单因素试验设计，体外发酵底物组成为象草和泌乳奶牛精料。其中，象草0.35 g、精料0.15 g，底物营养成分见表1。试验组添加5%底物干物质的亚油酸和亚麻酸，亚油酸和亚麻酸添加比例分别为0∶100、25∶75、50∶50、75∶25和100∶0，对照组不添加亚油酸和亚麻酸，每个处理5个重复。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T001表1底物营养成分（风干基础）项目粗蛋白/%能量/(MJ/kg)ADF/%NDF/%象草6.3317.4355.1091.01精料16.3016.5613.3462.871.3试验方法1.3.1体外培养体系本试验采用体外发酵瓶进行连续发酵培养，厌氧人工瘤胃液配制参照Marrez等[12]方法配置。缓冲液配方见表2。培养体系为50 mL。其中，人工瘤胃液40 mL、接种瘤胃液10 mL、培养瓶体积185 mL。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T002表2缓冲液配方表（1 mL体系含量）项目ABCD组成K2HPO4·3H2O 0.365 g(NH4)2SO4 0.6 g、NaCl 0.6 g、KH2PO4 0.3 g、MgSO4·7H2O 0.25 g、CaCl2·2H2O 0.08 gNa2CO3 5 gA+B+C混匀，通CO2至澄清，加半胱氨酸盐酸盐0.6 g，通CO2 20 min后分装1.3.2瘤胃液来源试验接种瘤胃液来自3头安装永久瘘管的奶水牛，奶牛体重（550±30）kg，饲喂象草和精料，精粗比2∶8，每天饲喂2次（8：00和15：00），自由饮水，8：00早饲前取瘤胃液于保温瓶中，迅速带至实验室，混合后经4层纱布过滤接种，整个过程持续通CO2。1.4测定指标及方法1.4.1瘤胃液体外发酵参数体外发酵样品采用便携式pH计（HANNA HI 8424）立即测定pH值，采用比色法检测瘤胃液NH3-N浓度[13]，采用考马斯亮蓝法检测MCP含量[14]。1.4.2甲烷和产气量培养瓶净产气量（mL）=时间段产气量（mL）-对应时间段空白均产气量（mL）(1)每段时间点内在检测完气体产量后立即用10 μL微量进样针吸取瓶内气体，采用气相色谱手动进样检测CH4含量。1.4.3样品VFA和纤维降解酶测定VFA浓度采用气相色谱（Agilent 7890A）测定，内标物为巴豆酸，色谱柱类型为HP-INNOWAX（19091N-133）毛细管柱30 m×0.25 mm×0.25 µm、进样口温度200 ℃、检测室温度220 ℃，色谱柱温度采用程序升温，80 ℃持续1 min后，以15 ℃/min升温至170 ℃后维持1.5 min；载气为高纯氮气、压力为100 kPa、总流量63.8 mL/min、柱流量1.19 mL/min、分流比50，吹扫流量3 mL/min、循环流量30 mL/min、H2流量40 mL/min、空气流量400 mL/min、进样量1 μL。1.4.4样品微生物区系瘤胃微生物DNA使用珠磨方法提取[15]。对细菌、真菌、原虫、甲烷菌进行qRT-PCR定量分析。引物序列见表3。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T003表3引物序列菌株类型引物引物序列（5'-3'）引物长度/bp参考文献总细菌FCGGCAACGACCGCAACCC130Denman等[16]RCCATTGTAGCACGTGTGTAGCC总真菌FGAGGAAGTAAAAGTCGTAACAAGGTTTC120Denman等[16]RCAAATTCACAAAGGGTAGGATGATT总原虫FGCTTTCGWTGGTAGTGTATT223Sylvester等[17]RCTTGCCCTCYAATCGTWCT总甲烷菌FTTCGGTGGATCDCARAGRGC140Denman等[18]RGBARGTCGWAWCCGTAGAATCC1.5数据统计与分析数据经Excel初步整理，采用SPSS 19.0软件进行一般线性模型分析，采用Duncan氏法进行组间多重比较。P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1添加亚油酸和亚麻酸对体外瘤胃发酵参数的影响（见表4）由表4可知，随着亚油酸添加比例的增加，瘤胃发酵液pH值显著降低（P0.05）。与对照组相比，在亚油酸添加剂量高于亚麻酸时，瘤胃液MCP浓度显著提高（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T004表4添加亚油酸和亚麻酸对体外瘤胃发酵参数的影响项目pH值NH3-N/(mg/100 mL)MCP/(g/L)对照组6.735bc12.43313.892c亚油酸∶亚麻酸0∶1006.820a11.68714.995bc25∶756.823a10.70615.383abc50∶506.783ab10.38416.270ab75∶256.758bc10.57716.084ab100∶06.715c10.35816.887aSEM0.0180.6330.555P值0.0020.1670.018注：同列数据肩标相同或无字母表示差异不显著（P0.05）,字母不同表示差异显著（P0.05）；下表同。2.2添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵VFA含量的影响（见表5）由表5可知，添加亚油酸和亚麻酸显著降低乙酸、丁酸浓度和乙酸/丙酸（P0.05），显著增加丙酸浓度（P0.05）；亚麻酸对乙酸、戊酸和总VFA浓度影响高于亚油酸（P0.05）；在亚油酸添加比例超过亚麻酸时，总VFA浓度不受影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T005表5添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵VFA含量的影响项目乙酸/(mmol/L)丙酸/(mmol/L)乙酸/丙酸丁酸/(mmol/L)戊酸/(mmol/L)总VFA/(mmol/L)对照组9.039a5.103e1.770a3.584a0.215a17.942a亚油酸∶亚麻酸0∶1006.133d6.806cd0.903b1.732b0.138c14.809b25∶756.251d6.560d0.954b2.079b0.160bc15.049b50∶506.485cd7.312bc0.887b1.865b0.211a15.873b75∶257.096bc8.085a0.880b2.064b0.213a17.458a100∶07.542b7.829ab0.964b1.962b0.182ab17.515aSEM0.2190.2040.0270.1190.0130.417P值0.0000.0000.0000.0000.0010.0002.3添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵产气量及甲烷产量的影响（见表6）由表6可知，添加亚油酸和亚麻酸能够显著降低水牛体外发酵产气量和CH4产量（P0.05）；亚麻酸对水牛体外发酵产气量和CH4产量抑制效果显著高于亚油酸（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T006表6添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵产气量及甲烷产量的影响项目产气量/(mL/g DM)甲烷产量/(mL/g DM)对照组189.500a168.700a亚油酸∶亚麻酸0∶10089.000d70.800d25∶75107.000c75.100d50∶50100.000cd77.300d75∶25123.000b95.300c100∶0134.000b113.200bSEM4.3952.734P值0.0000.0002.4添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵微生物结构的影响（见表7）由表7可知，添加亚油酸和亚麻酸对水牛瘤胃液体外发酵总细菌和真菌含量无显著影响（P0.05）；添加亚油酸和亚麻酸显著降低原虫和甲烷菌含量（P0.05）；随着亚麻酸添加比例增多，对原虫含量抑制效果显著增加（P0.05），但甲烷菌含量不受亚麻酸和亚油酸添加比例的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.001.T007表7添加亚麻酸和亚油酸对体外发酵微生物结构的影响项目总细菌/(lg copies/μg of DNA)总真菌/(lg copies/μg of DNA)总原虫/(lg copies/μg of DNA)总甲烷菌/(lg copies/μg of DNA)对照组10.6056.1656.003a6.645a亚油酸∶亚麻酸0∶1009.6975.415-3.157c4.325b25∶759.5525.645-3.800c4.605b50∶508.8425.837-3.867c4.613b75∶2510.0625.870-0.722b4.593b100∶09.5235.955-0.453b4.518bSEM0.4450.2790.3820.149P值0.1730.5280.0000.0003讨论3.1添加亚油酸和亚麻酸对体外瘤胃发酵参数的影响pH值是反映瘤胃内环境稳态的指标，受唾液分泌量、有机酸积累和日粮性质的影响。pH值过高或过低对瘤胃微生物的生长和饲料原料的发酵均产生不利影响[19]。瘤胃pH值在6.0~7.0范围适合瘤胃养分消化吸收[20]。有研究表明，瘤胃内环境能够适应日粮中添加不同浓度的油脂[21]。本研究中，体外发酵瘤胃液pH值在6.7~6.9之间，均在正常范围内。NH3-N浓度与发酵液中蛋白质降解速率、能氮平衡程度、微生物的利用效率相关[22]，瘤胃中适宜的NH3-N浓度是提高MCP合成效率的必要条件，浓度过高说明微生物利用氨的速度与生成氨的速度不协同，可能造成蛋白质的浪费。本研究中，添加亚油酸比例高于亚麻酸能够增加氨氮浓度，表明二者对水牛瘤胃液体外发酵类型的影响方式并不一样。在反刍动物中瘤胃MCP合成占十二指肠可吸收蛋白质的59％[23]。Gao等[24]研究发现，添加含3％的长链不饱和脂肪酸会增加细菌蛋白含量，原生动物蛋白含量降低和瘤胃微生物产脱氢酶活性增强可能由瘤胃发酵模式改变引起。本研究发现，添加亚油酸比例低于亚麻酸时MCP浓度提高，表明亚麻酸添加促进细菌发酵产生更多的MCP。3.2添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵脂肪酸含量的影响瘤胃VFA是反刍动物能量利用过程中的中间代谢产物，VFA含量反映瘤胃内环境状况以及饲料在瘤胃内的发酵模式和程度。VFA含量增加，表明微生物发酵能力增强；VFA含量降低会影响动物体内的能量供应[25]。瘤胃中产生的VFA能够提供动物所需能量的70%~80％，VFA含量及组成比例是反映瘤胃消化代谢活动的重要指标[26]。乙酸是动物合成脂肪的前体，也是乳脂合成的主要成分。在还原型辅酶Ⅱ（NADPH）供应充足的前提下，丁酸也可用于脂肪组织和乳腺组织的脂肪酸合成，乙酸、丁酸是乳脂合成中短链脂肪酸的主要底物[27]。丙酸是反刍动物体内主要生糖物质，丙酸含量的提高有助于改善动物的生产性能[28]。不同底物中亚油酸和亚麻酸的比例会改变瘤胃微生物的体外发酵类型[29]。Zhang等[30]研究发现，富含多不饱和脂肪酸的植物油和亚麻酸显著改变瘤胃发酵类型，增加总挥发性脂肪酸含量，降低乙酸和丙酸酸比例。有研究发现，在体外试验中添加十八碳脂肪酸后，乙酸与丙酸的比例明显下降[31]。本研究发现，水牛瘤胃液体外发酵添加亚油酸和亚麻酸均能降低乙酸产量，增加丙酸产量，有利于瘤胃微生物丙酸型发酵进程。3.3添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵产气量及甲烷产量的影响瘤胃内的气体主要为CO2和CH4，另外还有少量的N2和H2。其中，CH4大约占28.8％。产气量是对瘤胃微生物活性的间接反映。本研究中，底物中添加亚油酸和亚麻酸降低了产气量。瘤胃内CH4是有机物发酵的必然产物。瘤胃发酵过程中，CH4的产生同时也是反刍动物能量的损失，对环境同样造成负面影响，因此减少CH4产生与排放对反刍动物生产和全球环境保护具有重要意义[32]。饲喂高能饲料往往产生较少的CH4，因为淀粉消化有利于丙酸生产。生产丙酸是一种耗H2反应，减少H2含量可降低CH4产生。但是，日粮含有的高水平结构性碳水化合物能够产生高水平乙酸盐，在反应过程中释放H2[33]。补充油脂可以通过降低瘤胃产甲烷菌的活性或数量和原虫数量，抑制CH4排放[34]。通过不饱和脂肪酸的生物氢化减少H2含量，从而降低CH4产量[35]。体外[36]和体内[37]试验添加富含多不饱和脂肪酸的植物油，具有降低甲烷排放的效果；同时也表明植物油抑制甲烷的效果跟其不饱和度有关，本研究与上述报道一致。3.4添加亚油酸和亚麻酸对体外发酵微生物结构的影响瘤胃中主要的微生物菌群为细菌、原虫和真菌，瘤胃微生物中约95%由细菌组成[38]。多不饱和脂肪酸抑制CH4生成主要通过两个途径：一是作为氢的受体，改变了氢还原二氧化碳的代谢通路；二是影响瘤胃微生物组成。不饱和脂肪酸通过生物氢化作用为瘤胃发酵产生的氢提供可供选择的代谢通路，减少了可供甲烷菌利用的底物氢的数量。瘤胃原虫因与甲烷菌存在内外共生的关系而对甲烷生成有很大的贡献[39]。甲烷是由瘤胃中的产甲烷菌代谢产生的[40]，原虫因产生H2也参与甲烷生成，被产甲烷菌利用产生甲烷[41]。瘤胃中的不饱和脂肪酸可以抑制原虫的生长[42]，亚油酸对瘤胃原虫具有毒性，原虫数量会随亚油酸添加量增加而降低[43]。不饱和脂肪酸和富含不饱和脂肪酸的油脂显著降低甲烷生成和原虫数量[44]。有研究发现，不饱和脂肪酸对纯培养的甲烷菌[45]和混合培养的甲烷菌[30]有强烈的抑制作用。Popova等[46]报道，公牛产甲烷菌的代谢活性随着亚麻籽的添加而减少。因此，多不饱和脂肪酸可能是通过抑制甲烷生成相关菌（原虫和甲烷菌）来降低甲烷的生成。不饱和脂肪酸抑制甲烷的生成总是伴随着瘤胃发酵模式的改变，即丙酸比例的提高和乙酸丙酸比例的降低，而丙酸生成过程是与甲烷菌竞争底物氢的过程。本研究中，丙酸含量的升高和甲烷产量的降低证明了这一结论。综上所述，亚油酸和亚麻酸显著抑制甲烷生成，且亚麻酸效果高于亚油酸。4结论添加亚麻酸和亚油酸时显著影响体外瘤胃发酵参数和发酵类型，能够通过减少甲烷菌和原虫数量抑制瘤胃中CH4生成，降低产气量，且亚麻酸的抑制效果优于亚油酸，这可能与其不饱和度相关，尚需进一步研究多不饱和脂肪酸在水牛瘤胃代谢过程，为多不饱和脂肪酸在水牛生产中的应用提供更多参考依据。