吡咯喹啉醌（pyrroloquinoline quinone，PQQ）在葡萄糖无氧代谢研究过程中被发现，被科学家认为是氧化还原反应中起重要作用的物质[1]。机体氧化还原过程中PQQ作为电子受体或供体，在特定条件下可以与氢离子发生可逆反应形成PQQH2[2]。研究表明，PQQ可以提高动物生产性能、机体抗氧化能力和群体健康水平[3-5]，PQQ活性较强，使用更为稳定吡咯喹啉醌二钠（PQQ·Na2）进行试验研究。动物机体内抗氧化能力越强，延缓运动性疲劳的效果更强[6]。赛马是我国重要的特种经济动物。利用PQQ提高赛马抗氧化性能而提高其运动性能具有一定的研究价值。文章为赛马额外补充不同浓度的PQQ·Na2，观察其对赛马运动性能的影响，并通过活体穿刺收集不同组织样品，利用实时荧光定量（RT-qPCR）对不同组织中抗氧化基因的表达量进行统计，以分析PQQ在赛马体内的作用机制，为PQQ·Na2在赛马中的使用提供参考。1材料与方法1.1试验动物与材料赛马由内蒙古赛马俱乐部提供。PQQ·Na2购自上海医学生命科学研究中心有限公司，该产品由微生物发酵提纯而得，含量不低于99.9%。1.2试验设计将18匹3周岁、体貌一致、健康的蒙古赛马随机分为3组，分别是A、B、C组。A组为空白对照组，B、C两组补饲25、50 mg/d的PQQ·Na2。1.3饲养管理本试验持续30 d。试验阶段蒙古赛马均使用单槽饲喂，除训练时段外均在圈舍内活动。蒙古赛马粗料为燕麦秸秆，补充料参考刘凯[7]的研究进行配制。蒙古赛马补充料组成及营养水平见表1。根据马的采食习惯，全天饲料供给时段分别为7：30、11：30、16：30、21：00和0：00。马匹自由饮水，饲喂方式为先精料后粗料。PQQ·Na2在16：30时段放入水饮中给赛马服用，其余管理按照赛马俱乐部日常管理方式进行。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.018.T001表1补充料组成及营养水平（干物质计/%）原料组成含量/%营养水平总计100.00玉米11.00总能/（MJ/kg）24.40小麦麸2.20干物质/%93.65次粉2.20有机物/%94.05豆粕5.72粗蛋白/%8.90磷酸氢钙0.55中性洗涤纤维/%48.20食盐0.11酸性洗涤纤维/%23.20预混料0.22钙/%0.11燕麦秸78.00磷/%0.23注：预混合饲料由河北海金生物饲料有限公司生产。1.4测定指标及方法1.4.1运动性能分别在饲喂试验前后统计蒙古赛马的运动性能。赛马运动性能通过统计赛马完成1 000 m的时间进行判定，完成时间越短，说明运动性能越好。1.4.2血液生化指标在饲喂试验完毕且运动性能统计完毕后，对每匹赛马进行采血。为提高采血效率、样品的有效性，赛马静脉血采集方法为参考Walesby等[8]的研究。在收集2管（每管约5 mL）马静脉血后，分别做抗凝和无抗凝处理，静置10 min，3 000 r/min离心5 min，取上清液后分装，置于-20 ℃冰箱保存待测。根据国外研究[9-11]，检测血液中睾酮（T）含量、皮质醇（COR）、血红蛋白（HGB）、肌酸激酶（CK）活性、尿素氮（BUN）含量。T含量、CK活性、BUN含量使用电化学发光法检测[12]；COR使用放射免疫法检测[13]；HGB使用氰化正铁血红蛋白比色法测定[14]，相关的检测试剂与材料购自西门子医学诊断产品有限公司，具体操作见产品说明书。1.4.3抗氧化相关基因的筛选与引物设计样品收集：在运动性能测试完毕后，从每组随机筛选出3匹赛马加以保定，利用空间定位的超声引导肌肉穿刺法[15]获取赛马后腿肌肉样品约200 μg贮存于管内，盖好管口迅速放入液氮中，在-80 ℃冰箱中保存待用。引物设计：参考NCBI马的CAT、GPX1、SOD和CAT基因序列，利用该数据库中PrimerBlast工具保证引物特异性，利用Primer Premier 6.25软件设计引物，由北京诺禾致源科技股份有限公司合成引物。以β-actin基因作为内参基因，相关引物信息见表2。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.018.T002表2基因的引物序列信息基因名称引物序列（5'-3')引物长度扩增长度/bpGenBank登录号SOD上游引物：GATCACGGATTCCACGTCCA下游引物：TCCTTTGGTCCACCGTGTTT上游引物：22；下游引物：20103NM_001081826.3CAT上游引物：ACTCCCATTGCGGTTCGATT下游引物：AATTTCACCGCAAACCCACG上游引物：20；下游引物：2089XM_014729341.2GPX1上游引物：TGAGAATGTAGCGTCGCTCT下游引物：AGTGTGAAGTTGGGCTCGAA上游引物：20；下游引物：20207NM_001166479.1β-actin上游引物：TTCCCTGGAGAAGAGCTACG下游引物：TTTCGTGGATGCCACAGGAT上游引物：20；下游引物：20128XM_023655002.1总mRNA提取和cDNA合成：总mRNA提取试剂盒RNAprep pure Tissue Kit购自北京诺禾致源科技股份有限公司，总mRNA提取步骤与注意事项见参考说明书。使用反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix （Perfect Real Time）将总mRNA进行反转录，合成cDNA第1条链，置于-20 ℃冰箱中保存。RT-qPCR：以所得的cDNA第1条链为合成模版，将CAT、GPX1、SOD、CAT和β-actin引物进行扩增。利用Eva Green Ⅰ染料法，根据设定好的RT-qPCR反应条件和体系在Real-Time PCR Detection System仪器上进行。利用Bio-Rad CFX96TM软件分析和制作标准曲线，根据标准曲线和熔解曲线的循环阈值（Ct）计算定量结果。RT-qPCR反应体系：试剂为TB Green Premix Ex Taq II（Perfect Real Time）；模版为上述反转录反应液2 μL；反应体积25 μL；反应条件为90 ℃ 11s，95 ℃ 5s，59 ℃ 21s，72 ℃ 15 s，40个循环。1.5数据统计与分析抗氧化基因表达量以β-actin为内参基因，以相对表达量进行表述[16]。使用SAS 9.2统计学软件对数据进行单因素方差分析，并以Duncan氏法进行多重比较。试验数据以“平均值±标准误”表示。P0.05表示差异显著，P0.01表示差异极显著。2结果与分析2.1吡咯喹啉醌对赛马运动性能的影响（见表3）由表3可知，与对照组相比，B、C两组1 000 m竞赛完成时间分别显著下降3.87%和4.97%（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.018.T003表3吡咯喹啉醌对赛马运动性能的影响组别试验前赛马运动成绩试验后赛马运动成绩A83.32±1.8682.49±2.09aB82.29±2.0679.30±1.88bC83.01±1.6778.39±2.16b注：同列数据肩标不同小写字母表示差异显著（P0.05），不同大写字母表示差异极显著（P0.01），相同字母或无字母表示差异不显著（P0.05）；下表同。s2.2吡咯喹啉醌对赛马血液生化指标的影响（见表4）由表4可知，随着PQQ·Na2摄入量的增加，赛马血液中T含量呈显著上升（P0.05）；C组赛马血液中COR含量显著高于对照组（P0.05）；血液中CK活性随着PQQ·Na2摄入量的提高呈极显著上升（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.018.T004表4吡咯喹啉醌对赛马血液生化指标的影响组别T/(nmol/L)COR/(μg/L)HGB/（g/L）CK/(IU/L)BUN/(mmol/L)A25.28±2.67c210.58±41.88b134.23±8.13308.14±26.87C6.52±0.86B29.30±4.77b260.76±39.12ab129.58±7.64379.49±34.28B6.58±1.27C34.49±5.51a293.33±45.17a139.47±6.60481.28±65.74A6.69±1.032.3吡咯喹啉醌对赛马抗氧化相关基因表达的影响（见表5）由表5可知，B、C两组赛马SOD和CAT基因的表达量极显著高于对照组（P0.01），C组赛马GPX1基因的表达量极显著高于对照组（P0.01）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.018.T005表5吡咯喹啉醌对赛马抗氧化相关基因表达的影响组别SODCATGPX1A0.72±0.09C0.43±0.02B0.86±0.04BB1.16±0.10B0.90±0.06A0.90±0.03BC1.31±0.06A1.03±0.03A1.04±0.05A3讨论3.1吡咯喹啉醌对赛马运动性能的影响剧烈运动过程中，机体会产生大量自由基引发体内脂类物质等过氧化反应，反应对机体造成较大伤害，引起机体疲劳。研究表明，运动时自由基的增加量较为迅猛、骨骼肌细胞耗氧量可提高近200倍，随着运动强度和时间的增加而引起自由基过量，进而损害生物膜、影响大分子交联、失活，严重时可能导致生理功能紊乱[17]。PQQ作为氧化剂具有传递电子的作用，可以避免自由基对机体的危害[18]。在本研究中，赛马长时间额外补充PQQ·Na2可以有效减少因运动而产生自由基，进而提高其对运动系统的损伤，显著缩短赛马1 000 m的完成时间。3.2吡咯喹啉醌对赛马血液生化指标的影响T属于类固醇类化合物，可以促进新陈代谢[19]，促进肌肉蛋白合成，提高氨基酸利用率，加快骨骼肌发育，增强磷酸肌酸的合成，促使红细胞生成，提高糖原储备，并对运动后肌糖原恢复和疲劳消除有重要关联[20]。T对运动员的力量、速度的提升有重要作用。本试验中，随PQQ·Na2摄入量提高，赛马血液中T含量显著提高，说明PQQ·Na2可以通过加快T的合成进而提高赛马运动性能。COR也是类固醇类激素，主要可以促进糖异生，使蛋白质分解转化为糖，增强糖原利用率，增强运动过程中能量供应[21]。本研究结果表明，当PQQ·Na2每日摄入量为50 mg时才会使COR显著提高。HGB是反映运动员的携氧能力的重要生化指标，直接反映运动员的最大摄氧量、有氧运动能力和运动后的恢复能力。HGB可以作为评定运动员身体机能状态的重要指标[22]。氨是尿素的原料肌肉是机体氨生成的部位之一，运动时肌肉以丙氨酸形式释放氨，氨浓度与运动负荷成正比，血液中BUN浓度越高说明运动强度和负荷量越大，也可以反映机体运动损伤程度。但本研究表明，HGB和BUN没有受到PQQ·Na2摄入量的显著影响。CK是反映肌肉功能、生理状态的重要指标[23]。在运动过程中，血清CK浓度提高是因为肌肉能量消耗引起肌细胞膜电阻降低，导致游离Ca2+升高，运动过程中CK提高是正常的生理过程。宋春梅等[24]研究表明，CK在剧烈运动缺氧条件下活性会激素上升。因此，CK可以作为评价速度竞赛运动能力的指标。本研究中，CK活性随着PQQ·Na2摄入量而极显著提高，说明PQQ·Na2可以通过提高CK活性在速度赛马中提高马的运动能力。3.3吡咯喹啉醌对抗氧化相关基因表达的影响Zhang等[25]研究母猪日粮中添加PQQ对其抗氧化性能和抗氧化基因表达的影响，发现PQ可以增加母猪脐带、胎盘血和母乳的抗氧化能力，并使462个功能基因发生差异表达。Zhang等[26]利用RT-qPCR检测PQQ治疗受谷氨酸诱导的海马神经元细胞，发现PQQ对Nrf2的表达量有促进作用，其他抗氧化酶基因的表达也有提高。本研究的RT-qPCR结果表明，PQQ·Na2对SOD、CAT、GSH-Px合成相关基因的表达有促进作用，与上述研究结果类似。4结论长期补充饲喂PQQ·Na2 25 mg/d以上，可以提高赛马血液中T、COR浓度和CK活性，提高赛马的运动性能，提高运动过程中及运动后的一段时间内抗氧化基因的表达，有效缓解赛马肌肉疲劳和运动损伤。