精氨酸作为动物组织蛋白中最丰富的氮载体，能够在生物体内发挥重要的代谢和调节作用，是动物生长发育过程中的必需氨基酸，也是一氧化氮（Nitric oxide，NO）、多胺等生物活性物质的前体[1-2]。精氨酸有效外源添加量较高、价格昂贵[3]，与赖氨酸、色氨酸和组氨酸有一定的拮抗作用，未能在动物生产中作为饲料添加剂大量推广使用。N-氨甲酰谷氨酸（N-carbamylglutamate，NCG）是动物内源精氨酸合成的激活剂，可以低剂量、高效率地促进内源精氨酸的合成[4]。NCG化学合成方便，价格低廉[5]，有促进动物体肠道发育和增强免疫力等功能。NCG在家畜中的研究较多，在家禽方面鲜有报道，对鸡遗传性状影响的研究未见报道。试验从大骨鸡血液中抗氧化指标及生殖激素水平、第二性征指标以及睾丸发育情况等方面，研究NCG对大骨鸡生殖机能的影响，为大骨鸡的繁殖及科学饲养提供参考。1材料与方法1.1试验动物试验选用体重相近的11周龄大骨鸡公鸡。试验用鸡、场地及配备用具均由锦州医科大学大骨鸡试验场提供，所有饲养条件及免疫程序均按照大骨鸡饲养管理规程正常进行。1.2试验设计及饲养管理试验选用体重相近、健康状况良好的大骨鸡48只，随机分成4组（N1、N2、N3和C组），每组12只。其中，N组为试验组，NCG的添加水平依次为0.08%、0.12%、0.16%；C组为对照组，饲喂基础日粮。试验所使用的NCG由安徽普盛药业有限公司提供。饲养模式采用单层笼养，试验鸡每日8：00、12：00和18：00各饲喂1次，自由饮水和采食，执行常规免疫程序和饲养管理。试验期为11~22周龄。基础日粮组成及营养水平见表1。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T001表1基础日粮组成及营养水平（风干基础）原料组成含量/%营养水平合计100.00玉米63.82代谢能/(MJ/kg)11.09小麦麸8.00粗蛋白/%15.50大豆粕16.00钙/%0.75玉米DDGS8.00有效磷/%0.34磷酸氢钙1.20赖氨酸/%0.80石粉1.20蛋氨酸/%0.25食盐0.25蛋氨酸+半胱氨酸/%0.61小苏打0.20色氨酸/%0.16预混料1.00粗纤维/%3.53蛋氨酸0.09粗脂肪/%3.95赖氨酸0.22粗灰分/%6.11色氨酸0.02注：预混料为每千克日粮提供：Fe 80 mg、Cu 8 mg、Mn 100 mg、Zn 80 mg、I 0.7 mg、Se 0.3 mg、VA 6 500 IU、VD 850 IU、VE 12.5、VK 0.85 mg、VB1 0.7 mg、VB2 4.5 mg、泛酸9.2 mg、烟酸28 mg、VB6 2.8 mg、生物素0.14 mg、叶酸0.6 mg、VB12 0.012 mg、胆碱950 mg。1.3测定指标及方法1.3.1血液抗氧化指标和生殖激素每组随机选择6只鸡，分别于16、22周龄翅下采集静脉血液3 mL，置于含肝素钠和EDTA的抗凝管中，4 ℃、3 000 r/min离心15 min，吸取上清置无菌冻存管中，用于测量血液中一氧化氮（NO）、总抗氧化能力（T-AOC）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、双氢睾酮（DHT）、睾酮（T）、促性腺激素释放激素（GnRH）等指标。1.3.2第二性征指标16、22周龄时，每组随机选取3只试验鸡，禁食12 h，颈动脉放血法处死，测量大骨鸡的冠高、冠长、冠高、冠厚以及肉垂重等第二性征指标。1.3.3睾丸发育指标大骨鸡处死后，分别对其左右两侧的睾丸进行称重和睾丸指数计算，取一侧睾丸进行石蜡组织切片的制作及HE染色，在显微镜下观察并测量曲细精管宽度以及管壁厚度。1.4数据统计与分析试验数据采用SPSS 26.0进行单因素方差分析，结果以“平均数±标准误”表示，P0.05表示差异显著。2结果与分析2.1NCG对大骨鸡血液抗氧化指标和生殖激素水平的影响2.1.1NCG对大骨鸡血液中抗氧化指标的影响（见表2）由表2可知，NCG对血液中NO水平及抗氧化指标均无显著影响（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T002表2NCG对大骨鸡血液中抗氧化指标的影响周龄/w组别NO/(μmol/g prot)T-AOC/(mmol/L)T-SOD/(U/mL)16N1181.624±36.4810.589±0.035220.207±8.091N2176.758±15.9280.596±0.029224.785±4.093N3209.373±9.3990.685±0.047224.673±5.508C188.471±19.0590.694±0.056216.968±11.17822N141.111±2.7963.570±0.091263.268±24.008N255.111±8.7323.274±0.131243.050±16.589N342.667±6.2223.241±0.078277.464±20.454C56.667±11.6713.284±0.154258.106±54.958注：同列同周龄数据肩标无字母或相同字母表示差异不显著（P0.05），不同字母表示差异显著（P0.05）；下表同。2.1.2NCG对大骨鸡血液中生殖激素水平的影响（见表3）由表3可知，16周龄时，N3组大骨鸡血液T含量显著高于其他各组（P0.05）；22周龄时，N1组大骨鸡血液T和GnRH含量均显著高于其他各组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T003表3NCG对大骨鸡血液中生殖激素水平的影响周龄/w组别DHT/(ng/L)T/(nmol/L)GnRH/(ng/L)16N1325.761±132.49935.084±2.848b445.674±31.976N2402.526±178.43940.839±1.596b467.998±54.469N3468.073±170.00553.328±5.660a392.827±41.728C339.995±112.61639.428±1.428b408.887±21.64222N144.644±5.80370.294±9.460a558.978±21.237aN293.946±26.29842.493±3.851b468.428±31.050bN3113.697±20.90644.092±4.302b458.463±32.778bC77.175±25.53942.560±4.158b462.565±28.602b2.2NCG对大骨鸡第二性征发育的影响2.2.1NCG对大骨鸡鸡冠发育的影响（见表4）由表4可知，16周龄时，N1组大骨鸡的鸡冠重量、厚度和长度均显著高于对照组（P0.05）；N2组大骨鸡的鸡冠厚度显著高于对照组（P0.05）；N3组大骨鸡的鸡冠高度、冠重、冠长以及冠厚均显著提高（P0.05）。22周龄时，N3组大骨鸡的各个指标显著高于对照组（P0.05），N1组的鸡冠厚度显著低于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T004表4NCG对大骨鸡鸡冠发育的影响周龄/w组别冠重/g冠长/cm冠高/cm冠厚/cm16N112.350±0.955a8.528±0.167a4.371±0.174ab1.631±0.017aN26.843±0.213b7.213±0.021b3.688±0.033c1.588±0.006aN312.365±1.980a8.592±0.556a4.474±0.313a1.530±0.071aC7.030±0.865b7.284±0.219b3.798±0.250bc1.261±0.058b22N123.205±3.577b10.623±0.460b5.382±0.284b1.520±0.056cN220.787±2.654b9.824±0.245b4.945±0.079b1.634±0.040bcN335.385±2.776a12.168±0.257a6.155±0.173a2.135±0.052aC20.472±2.485b9.869±0.322b4.865±0.200b1.762±0.116b2.2.2NCG对大骨鸡肉垂发育的影响（见表5）由表5可知，NCG添加组大骨鸡的肉垂重量均高于对照组，说明饲粮中添加NCG可在一定程度上增加公鸡肉垂的重量。16周龄时，N3组大骨鸡的左侧肉垂重量显著高于对照组（P0.05），22周龄时，N3组大骨鸡右侧肉垂重量显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T005表5NCG对大骨鸡肉垂发育的影响周龄/w组别肉垂重左右16N13.065±0.186ab1.900±0.442N23.091±0.031ab1.745±0.062N33.359±0.255a2.300±0.218C2.835±0.108b1.740±0.08122N14.137±0.5424.100±0.612abN23.277±0.3243.570±0.503abN35.343±1.7435.173±1.067aC3.067±0.7722.510±0.629bg2.3NCG对大骨鸡睾丸发育的影响2.3.1NCG对大骨鸡睾丸重及睾丸指数的影响（见表6）由表6可知，16周龄时，试验组的双侧睾丸的重量及睾丸指数均显著高于对照组（P0.05），且N1组的睾丸重量和睾丸指数最高；22周龄时，4组间均无显著差异（P0.05）10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T006表6NCG对大骨鸡睾丸重及睾丸指数的影响周龄/w组别睾丸重/g睾丸指数/%左右左右16N111.666±1.458a11.463±1.355a0.408±0.041a0.397±0.037aN28.687±0.650a8.370±0.722b0.338±0.027a0.325±0.031aN310.619±1.166a9.861±1.103ab0.394±0.051a0.365±0.047aC3.913±0.429b4.154±0.419c0.146±0.016b0.162±0.017b22N119.103±2.79217.397±2.9170.643±0.0840.584±0.046N218.747±2.50317.217±3.4270.429±0.0650.476±0.086N318.340±1.81618.337±1.7410.451±0.0450.487±0.091C17.940±3.40920.257±4.5800.612±0.1230.696±0.0552.3.2NCG对大骨鸡睾丸组织形态的影响（见表7、图1、图2）由表7可知，16周龄时，N2和N3组大骨鸡的曲细精管宽度显著高于对照组（P0.05）；22周龄时，N2和N3组管壁厚度显著低于对照组（P0.05），N3组曲细精管宽度显著高于对照组（P0.05）。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.T007表7NCG对大骨鸡睾丸组织形态的影响周龄/w组别曲细精管宽度管壁厚度16N1206.679±6.264c2.122±0.194bN2231.156±11.520b2.168±0.155bN3268.024±5.337a2.929±0.170aC201.259±9.260c2.532±0.304ab22N1187.777±3.321c2.402±0.272abN2214.055±7.785ab2.228±0.109bcN3227.433±5.551a1.794±0.131cC197.449±8.045bc2.734±0.203aμm由图1、图2可知，16周龄时曲细精管的管腔中已经开始有精子生成，且添加NCG的组生成的精子数量较对照组多，说明添加NCG的饲料对睾丸中精子的生成具有积极的影响。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.F001图116周龄睾丸组织形态注：ST为曲细精管，TW为管壁；下图同。10.13557/j.cnki.issn1002-2813.2021.07.012.F002图222周龄睾丸组织形态3讨论3.1NCG对大骨鸡血液抗氧化指标和生殖激素水平的影响精氨酸可以通过NO信号通路促进线粒体的生物发生和生物学功能，NO是参与调节细胞内氧化还原环境的信号分子之一。NO在促血管生成、缺血重构、壁细胞生成、血流储备等方面发挥着重要作用[6]。本试验中，16周和22周龄大骨鸡血液中NO水平与对照组差异不显著，可能与公鸡性发育期血液代谢旺盛有关。在动物机体的发育过程中，NO参与机体内激素的合成，当血液中激素水平迅速上升时，对NO的消耗也随之增大，这可能也是NO水平差异不显著的原因。精氨酸可以参与糖代谢、氨基酸和蛋白质合成，调节机体抗氧化能力，而NCG属于精氨酸的一个内源合成激活剂，可以预测饲粮中添加NCG是否可以提高动物机体的抗氧化能力。T-AOC和T-SOD是清除活性氧抗氧化系统的重要组成部分。T-AOC与清除自由基能力相关[7]。T-SOD能够促进超氧自由基（·O2-）发生突变，生成氧和过氧化氢，然后过氧化氢被GSH-Px还原为谷胱甘肽和水，CAT还原为氧和水。因此，T-SOD能够有效减少氧化物的积累和产生，进一步减少对细胞和组织的损伤[6]。但本研究中，饲粮中添加NCG对血浆中的总抗氧化能力在16周龄时几乎没有影响，22周龄时对提高机体的抗氧化能力有微弱的影响；N3组的T-SOD含量比对照组有所提高，说明饲粮中添加0.16%水平的NCG对动物机体的抗氧化能力有一定作用。睾丸的正常功能取决于体内和体外通过内分泌和旁分泌途径起作用的激素[8]。类固醇激素在鸡胚胎的繁殖、发育和生长中起着重要作用。DHT是最有效和普遍的内源性类固醇激素，它在性腺中分泌，然后扩散到血液里，最后作用于靶细胞[9]。血液中类固醇激素的含量间接反映机体可用激素的水平。本研究发现，16周龄和22周龄大骨鸡的DHT含量随着NCG添加水平的增加而变大，但与对照组相比没有出现显著差异，说明NCG的添加可以在一定程度上增加动物血液中DHT的含量，且这种影响随着NCG水平的增加而增大。T主要调控精子的发生和成熟，维持第二性征的正常发育。T由睾丸的间质细胞分泌，它的含量直接反映公鸡繁殖性能。本研究发现，16周龄时N3组大骨鸡的T水平显著高于对照组，但到22周龄，N1组大骨鸡的T水平显著高于对照组。因此，本研究推测，NCG影响大骨鸡睾丸的生长发育及类固醇激素的生成与代谢，进而促进线粒体的生成，但该作用受动物所处生理阶段和剂量影响。由下丘脑产生和分泌的GnRH是启动和调节生殖功能的关键途径[10]，能够刺激垂体促性腺激素的生物合成和分泌促卵泡激素和促黄体生成素[11]。本研究结果显示，NCG添加组大骨鸡的GnRH的含量较对照组均有所提高，特别是N1组，16周龄时虽然差异不显著，但其GnRH的含量仍然高于对照组，到22周龄，N1组大骨鸡的激素含量显著高于对照组。这可能与下丘脑-垂体-睾丸轴的发育及生殖激素调控网络有关。3.2NCG对大骨鸡第二性征发育的影响公鸡的第二性征包括鸡冠、肉垂等，它们间接反映着公鸡的雄性化发育程度。有研究表明，鸡冠的面积与公鸡睾丸的质量有着显著的相关性，肉垂长与睾丸的质量呈弱相关[12]。本研究发现，添加NCG的组大骨鸡与对照组相比鸡冠相关指标均有不同程度的提高，16周龄时，N1组大骨鸡的冠重、冠长和冠厚都比对照组有着显著的增加，而N3组大骨鸡在冠重、冠高、冠长和冠厚等方面均远远高于对照组；22周龄时，N3组大骨鸡在鸡冠各个方面的指标与对照组形成显著的对比。在肉垂方面，N3组大骨鸡在16周龄和22周龄的肉垂重量均显著高于对照组，说明在饲粮中添加0.16%水平的NCG对公鸡第二性征的发育具有显著的促进作用。3.3NCG对大骨鸡睾丸发育的影响有研究表明，公鸡的睾丸在12~20周龄期间的生长发育最迅速[13]，早期的睾丸发育对提高公鸡的繁殖性能至关重要[14]。本试验发现，公鸡的左侧睾丸重量大于右侧，但差异不显著，与岳占碰等[15]的研究结果相似。另外，本试验研究发现，在16周龄时，NCG添加组大骨鸡的睾丸不论左侧还是右侧，其重量以及睾丸指数均显著高于对照组，且N1组差别最明显，但是22周龄时，各个组间差异不大。这说明16周龄是睾丸发育最快的时间，NCG在睾丸快速发育时期对其质量影响最大，且最佳水平是0.08%，22周龄时睾丸发育基本趋于稳定，此时添加的NCG对其影响不大。因此，可以推测NCG具有促进睾丸发育的作用。公鸡睾丸曲细精管的发育成熟是其达到性成熟的主要特征，曲细精管管腔大小能够间接反映睾丸的发育程度。本试验发现，16周龄时N2和N3组的曲细精管宽度均显著高于对照组，且N3组在22周龄时的曲细精管宽度仍显著高于对照组，说明饲粮中添加0.16%水平的NCG能极大地促进曲细精管的发育；但在22周龄时，N2和N3组的曲细精管管壁都有不同程度的变薄，因此，管腔变大的原因还有待进一步研究。4结论本研究表明，饲粮中添加NCG能促进公鸡睾丸、第二性征发育，提高血液中GnRH、DHT和T等生殖激素水平，且NCG的最佳水平与公鸡所处生理时期有关。